紫貽貝多糖酶法制備工藝研究

韓 瑩，曲有樂

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

紫貽貝多糖酶法制備工藝研究

韓 瑩，曲有樂

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶分別提取紫貽貝粗多糖，以及木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復合酶提紫貽貝粗多糖，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶復合酶提紫貽貝粗多糖。并分析研究加酶量、料液比、pH和溫度對紫貽貝提取率的影響。結果顯示：木瓜蛋白酶最佳加酶量1%，料液比1:15 g/mL，pH為7，溫度為60℃。提取率為6.65%。中性蛋白酶最佳為加酶量2%，料液比1:15 g/mL，pH為7，溫度為50℃，提取率為5.52%。堿性蛋白酶最佳加酶量為2%，料液比1:15 g/mL，pH為10，溫度為50℃，提取率為6.89%。木瓜蛋白酶與中性蛋白酶兩步聯合酶提取最佳提取條件為加酶量1%，料液比1:20 g/mL，pH為7，溫度為50℃，此條件下提取率為6.86%。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合酶提最佳提取條件為加酶量1%，料液比1:20 g/mL，木瓜蛋白酶緩沖液pH為7，堿性蛋白酶緩沖液pH為10，溫度為50℃，此條件下提取率為7.27%。

紫貽貝；粗多糖；提取工藝

隨著我國經濟與科技的發展，社會各界人士越來越關注海洋資源的開發與利用。紫貽貝俗稱海虹，亦稱為淡菜，在我國沿海地區廣泛分布，如浙江舟山、渤海、黃海等海域。紫貽貝的藥用價值、營養價值和經濟價值較高[1-3]。相關研究表明，紫貽貝的提取物具備提高免疫力、抗氧化和抗腫瘤等作用[4-6]。《本草綱目》記載：貽貝肉能治“虛勞傷脾，精血衰少，吐血久痢，腸鳴腰痛”。紫貽貝的營養價值僅次于雞蛋，因此紫貽貝亦有“海中雞蛋”之稱[7-9]。由于紫貽貝具有季節性、區域性的特點，新鮮紫貽貝不便于運輸，影響紫貽貝的營養價值和藥用價值的充分開發與利用，因此對紫貽貝的進一步研究具有深遠的社會意義和現實意義。

本實驗原料為舟山嵊泗島紫貽貝，通過對紫貽貝提取工藝的研究，為貝類開發研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

1.1.1 材料和試劑

供試原料紫貽貝，采購自來自浙江舟山嵊泗，經專家鑒定后，清洗干凈，取紫貽貝肉，去足絲，冷藏于-20℃冰柜，備用。

石油醚、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、95%乙醇、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器和設備

JJ-2組織搗碎機，上海創奕科教設備有限公司；LGJ-10D冷凍干燥機，上海雙旭電子有限公司；N-1100旋轉蒸發儀，北京佳源興業科技有限公司；UV-1800PC紫外分光光度計，濟南思奇醫療設備有限公司；TD5K大容量高速離心，長沙東旺實驗儀器有限公司；SOXTEC2045脂肪測定儀，上海瑞玢國際貿易有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 紫貽貝粗多糖的提取

取紫貽貝肉，用組織搗碎機將新鮮紫貽貝肉勻漿，進行冷凍干燥，磨粉。用索氏提取法將紫貽貝粉脫脂，即得紫貽貝粉。稱取紫貽貝粉末1 g，過20目篩加入緩沖液，分別加入定量的木瓜蛋白酶，中性蛋白酶以及堿性蛋白酶，水解一段時間后，將水升溫至99℃進行滅酶30 min。待冷卻至室溫，調pH至中性。4 000 r/min離心15 min，取上清液。用旋轉蒸發儀將上清液濃縮至原體積的1/3，用4倍體積的95%乙醇進行醇沉，放置于4℃冰箱過夜，次日離心取沉淀，將沉淀進行冷凍干燥，干燥后的樣品即為紫貽貝粗多糖。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制

用苯酚-硫酸法測定多糖含量[10]。精密稱取0.010 g葡萄糖（分析純），加蒸餾水定容至100.0 mL，得到0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液，精確吸取葡萄糖標準溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL分別置于10 mL的試管中，補加蒸餾水至2 mL，加入5%的苯酚溶液1 mL，混勻后快速加入5 mL的濃硫酸，搖勻放入水浴鍋中沸水煮15 min，冷卻后測定其紫外吸光值。以2.0 mL的蒸餾水為空白對照，以吸光度為橫坐標，以葡萄糖質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線（圖1），并計算其標準回歸方程。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

1.2.3 多糖含量的測定

稱取精準紫貽貝粗多糖0.010 g，放入容量瓶加蒸餾水定容至100.0 mL。精確量取溶液1 mL，加蒸餾水補至2 mL，加入5%苯酚1 mL混勻，快速加入濃硫酸5 mL，震搖后放入水浴鍋煮沸15 min，冷卻至室溫，用紫外分光光度計在490 nm處測其吸光值。按“多糖提取率=樣品中多糖含量（mg）/干貽貝粉質量（g）× 100%”計算多糖含量[11]。

1.2.4 提取工藝因素確定

1.2.4.1 單酶提取

本實驗考察了木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶對紫貽貝粗多糖提取率的影響因素，進行了加酶量、料液比、浸提溫度、pH四個因素的單因素實驗[12]。

（1）不同加酶量對紫貽貝粗多糖提取率的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉九等份分別放入9個錐形瓶內，用量筒量取20 mL緩沖液并倒入錐形瓶，分別調木瓜蛋白酶和中性蛋白酶緩沖液pH為7，調堿性蛋白酶緩沖液pH為10，再分別加入0.5%，1%，2%的木瓜蛋白酶，中性蛋白酶與堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，溫度調至50℃，浸提3 h，記錄分析不同蛋白酶的不同加酶量對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

（2）不同料水比對紫貽貝粗多糖提取率的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉九等份分別放入9個錐形瓶內，用量筒分別量取緩沖液，并按1:15，1:20，1:25的比例加入錐形瓶，調要加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的緩沖液pH為7，調要加入堿性蛋白酶緩沖液pH為10，并分別加入2%的木瓜蛋白酶，中性蛋白酶與堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，溫度調至50℃，浸提3 h，記錄分析不同料水比對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

（3）不同浸提溫度對紫貽貝粗多糖提取率的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉九等份分別放入9個錐形瓶內，用量筒量取緩沖液20 mL加入錐形瓶，調準備加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶緩沖液pH為7，調準備堿性蛋白酶緩沖液pH為10，再分別加入2%的木瓜蛋入白酶，中性蛋白酶和堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，溫度分別調至40℃、50℃、60℃，浸提3 h，提取完畢沸水滅酶。記錄分析不同蛋白酶的不同浸提溫度對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

（4）緩沖液pH值對紫貽貝粗多糖提取率的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉九等份分別放入9個錐形瓶內，用量筒量取緩沖液20 mL加入錐形瓶，分別調木瓜蛋白酶和中性蛋白酶緩沖液pH為6、7、8，調堿性蛋白酶緩沖液pH為9、10、11，再分別加入2%的木瓜蛋白酶，中性蛋白酶和堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，溫度調至50℃浸提3 h，提取完畢，沸水滅酶。記錄分析不同蛋白酶緩沖液的不同pH對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

1.2.4.2 單酶提取工藝正交實驗

以加酶量、料水比、pH和浸提溫度4個因素，每個因素3個水平選擇四因素三水平正交試驗（表1、表2、表3），考察紫貽貝粗多糖最佳提取工藝。

表1 木瓜蛋白酶正交試驗因素與水平Tab.1 The orthogonal test factors and levels of papain

表2 中性蛋白酶正交試驗因素與水平Tab.2 The orthogonal test factors and levels of neutral protease

表3 堿性蛋白酶正交試驗因素與水平Tab.3 The orthogonal test factors and levels of alkaline protease

1.2.4.3 兩步聯合酶提

上述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶單因素最優提取條件的研究為進行木瓜蛋白酶和中性蛋白酶兩步聯合酶提以及木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合酶提的研究提供了依據。通過分析比較研究結果，優化紫貽貝粗多糖的提取條件。

（1）木瓜蛋白酶、中性蛋白酶兩步聯合提取紫貽貝粗多糖

a、加酶量對紫貽貝粗多糖提取的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉三等份分別放入3個錐形瓶內，用量筒量取緩沖液20 mL加入錐形瓶，調緩沖液pH為7，加入1%的木瓜蛋白酶，50℃浸提3 h，提取完畢，升溫至99℃滅酶30 min。冷卻至室溫，調pH為7。再分別加入1%的中性蛋白酶，50℃浸提3 h，提取完畢沸水滅酶。記錄分析不同加酶量對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

b、料水比對紫貽貝粗多糖提取的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉三等份分別放入3個錐形瓶內，用量筒分別按比例量取緩沖液1:15，1:20，1:25并加入錐形瓶，調緩沖液pH為7，加入1%的木瓜蛋白酶，50℃浸提3 h，提取完畢，升溫至99℃滅酶30 min。調pH至中性。再加入1%的中性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，調溫至50℃，浸提3 h，提取完畢，沸水滅酶。記錄分析不同料水比對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

c、浸提溫度對紫貽貝粗多糖提取的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉三等份分別放入3個錐形瓶內，用量筒按比例量取緩沖液20 mL，并加入錐形瓶，調緩沖液pH為7，加入1%的木瓜蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，分別調溫至40℃、50℃、60℃浸提3 h，提取完畢，升溫至99℃滅酶30 min。冷卻至室溫，調pH至為7，再加入1%的中性蛋白酶，依然按40℃、50℃、60℃浸提3 h。提取完畢，沸水滅酶。記錄分析不同浸提溫度對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

（2）木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶兩步聯合提取

a、加酶量對粗多糖提取的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉三等份分別放入3個錐形瓶內，用量筒量取緩沖液20 mL并加入錐形瓶，調緩沖液pH為7，分別加入1%的木瓜蛋白酶，50℃浸提3 h，提取完畢，升溫至99℃滅酶30 min。冷卻至室溫，調pH為10。再分別加入1%的堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，調溫至50℃浸提3 h。記錄分析不同加酶量對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

b、料水比對粗多糖提取的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉三等份分別放入3個錐形瓶內，按比例1:15、1:20、1:25加入緩沖液，調緩沖液pH為7，分別加入1%的木瓜蛋白酶，50℃浸提3小時，提取完畢，升溫至99℃滅酶30 min。冷卻至室溫，調pH至10。再加入1%的堿性蛋白酶，放入恒溫水浴鍋，調溫至50℃浸提3 h。記錄分析不同加酶量對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

c、溫度對粗多糖提取的影響

精準稱量1 g紫貽貝粉三等份分別放入3個錐形瓶內，用量筒量取20 mL的緩沖液，分別加入錐形瓶，調緩沖液pH為7，加入1%的木瓜蛋白酶，分別按40℃、50℃、60℃浸提3 h，提取完畢，升溫至99℃滅酶30 min。冷卻至室溫，調pH至10。再加入1%的堿性蛋白酶，按40℃、50℃、60℃浸提3 h。記錄分析不同浸提溫度對紫貽貝粗多糖提取率的影響。

2 結果與分析

2.1 單酶提取單因素實驗

由圖2～4可知，分別加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的紫貽貝粗多糖提取率隨著加酶量的增加而增加，加酶量在1%時達到最高，隨之降低。粗多糖提取率分別可達5.69%、6.47%、7.08%。由圖5～7可知，紫貽貝的粗多糖提取率隨料液比的增加而增加，在料液比達到1:20時為最大值，隨之降低。粗多糖提取率分別可達5.26%、6.31%、7.03%。由圖8～10可知，加木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的紫貽貝粉粗多糖提取率在pH為7時達到最優值，提取率分別為5.57%、5.99%。加堿性蛋白酶的紫貽貝粉粗多糖提取率在pH為10時達到最優值，提取率為6.83%。由圖11～13可知，粗多糖提取率浸提溫度的不斷升高，升高到50℃為最高值，隨后下降。粗多糖提取率分別為5.11%、5.62%、5.63%。

圖2 木瓜蛋白酶加酶量對多糖提取率的影響Fig.2 The influence of the dosage of papain's enzyme of the rate of extraction

圖3 中性蛋白酶加酶量對多糖提取率的影響Fig.3 The influence of the dosage of neutral protease's enzyme of the rate of extraction

圖4 堿性蛋白酶加酶量對多糖提取率的影響Fig.4 Theinfluenceofthedosageofalkaline protease'senzymeoftherateofextraction

圖5 木瓜蛋白酶料液比對多糖提取率的影響Fig.5 The influence of the radio of raw material to solvent of papain of the rate of extraction

圖6 中性蛋白酶料液比對多糖提取率的影響Fig.6 The influence of the radio of raw material to solvent of neutral protease of the rate of extraction

圖7 堿性蛋白酶料液比對多糖提取率的影響Fig.7 The influence of the radio of raw material to solvent of alkaline protease of the rate of extraction

圖8 木瓜蛋白酶pH對多糖提取率的影響Fig.8 The influence of the pH of papain of the rate of extraction

圖9 中性蛋白酶pH對多糖提取率的影響Fig.9 The influence of the pH of neutral protease of the rate of extraction

圖10 堿性蛋白酶pH對多糖提取率的影響Fig.10 The influence of the pH of alkaline protease of the rate of extraction

圖11 木瓜蛋白酶提取溫度對多糖提取率的影響Fig.11 The influence of the extraction temperature of papain of the rate of extraction

圖12 中性蛋白酶提取溫度對多糖提取率的影響Fig.12 The influence of the extraction temperature of neutral protease of the rate of extraction

圖13 堿性蛋白酶提取溫度對多糖提取率的影響Fig.13 The influence of the extraction temperature of alkaline protease of the rate of extraction

2.2 正交試驗

試驗結果（表4～6）表明，木瓜蛋白酶酶提溫度、pH、加酶量和料液比這4種因素對紫貽貝粗多糖提取率的影響大小依次為A>B>C>D，即加酶量>料液比>pH>溫度。紫貽貝粗多糖最優提取條件為A2 B1C3D3，即木瓜蛋白酶最優提取條件為加酶量1%，料液比1:15 g/mL，pH為7，溫度為60℃。在此條件下，紫貽貝粗多糖提取率為6.65%。試驗結果（表4）表明，中性蛋白酶酶提溫度、pH、加酶量和料液比4種因素對紫貽貝粗多糖提取率的影響大小依次為C>D>B>A，即pH>溫度>料液比>加酶量。紫貽貝粗多糖最優提取條件為A3B1C3D2，即中性蛋白酶最優提取條件為加酶量2%，料液比1:15 g/mL，pH為7，溫度為50℃。在此條件下，紫貽貝粗多糖提取率為5.52%。試驗結果（表5）表明，堿性蛋白酶酶提溫度、pH值、加酶量和料液比4種因素對紫貽貝粗多糖提取率的影響大小依次為A>D>C>B，即加酶量>溫度>pH值>料液比。紫貽貝粗多糖最優提取條件為A3B1C3D2，即堿性蛋白酶最優提取條件為加酶量2%，料液比1:15（g/mL），pH為10，溫度為50℃。在此條件下，紫貽貝粗多糖提取率為6.89%。

表4 木瓜蛋白酶單因素正交表Tab.4 The orthogonal single factors of papain

表5 中性蛋白酶單因素正交表Tab.5 The orthogonal single factors of neutral protease

表6 堿性蛋白酶單因素正交表Tab.6 The orthogonal single factors of alkaline protease

2.3 兩步聯合酶提單因素實驗

從圖14～19可以看出，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶兩步聯合酶提的提取率隨著加酶量的增加隨之升高，但升高到1%時達到最優值，隨之下降。在加酶量為1%時，粗多糖提取率為6.86%。紫貽貝的粗多糖提取率隨料液比的增加而增加，在料液比達到1:20時達到最優值，隨之下降。粗多糖提取率為6.65%。紫貽貝粗多糖隨著浸提溫度的升高先升高而升高，升高到50℃時為最大值，隨后降低，粗多糖提取率達6.86%。木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶兩步聯合酶提的提取率隨著加酶量的增加而增加，提取率升高到1%時達到最優值，隨后降低，粗多糖提取率為7.27%。紫貽貝的粗多糖提取率隨料液比的增加先升高再降低，在料液比達到1:20時達到最優值，粗多糖提取率為7.26%。紫貽貝粗多糖隨著浸提溫度的升高先升高再降低，升高到50℃時為最大值，提取率達7.19%。并且經過對比實驗可知，先加木瓜蛋白酶后加中性蛋白酶聯合酶解比同時加木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解所得粗多糖的總糖含量高。先采用木瓜蛋白酶后加堿性蛋白酶聯合酶解提取率比先加堿性蛋白酶后加木瓜蛋白酶酶解所得粗多糖的總糖含量高。且木瓜蛋白酶與中性蛋白酶兩步聯合酶提以及木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶兩步聯合酶提所得提取率高于三種單酶單獨提取紫貽貝粗多糖的提取率。

圖14 木瓜蛋白酶和中性蛋白酶兩步聯合酶提加酶量對多糖提取率的影響Fig.14 The influence of the dosage of papain and Neutral protease's enzyme of the rate of extraction

圖15 木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合酶提加酶量對多糖提取率的影響Fig.15 The influence of the dosage of papain and alkaline protease's enzyme of the rate of extraction

圖16 木瓜蛋白酶和中性蛋白酶兩步聯合酶提料液比對多糖提取率的影響Fig.16 The influence of the radio of raw material to solvent of papain and neutral protease of the rate of extraction

圖17 木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合提料液比對多糖提取率的影響Fig.17 The influence of the radio of raw material to solvent of papain and alkaline protease of the rate of extraction

圖18 木瓜蛋白酶和中性蛋白酶兩步聯合酶提溫度對多糖提取率的影響Fig.18 The influence of the extraction temperature of papain and neutral protease of the rate of extraction

圖19 木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合酶提溫度對多糖提取率的影響Fig.19 The influence of the extraction temperature of papain and alkaline protease of the rate of extraction

3 結果與討論

對影響紫貽貝粗多糖提取率的因素包括加酶量、料液比、pH和溫度，通過單因素實驗得出了各因素的最佳水平，即木瓜蛋白酶最佳加酶量1%，料液比1:15 g/mL，pH為7，溫度為60℃。中性蛋白酶最佳為加酶量2%，料液比1:15 g/mL，pH為7，溫度為50℃。堿性蛋白酶最佳加酶量為2%，料液比1:15 g/mL，pH為10，溫度為50℃。在此條件下，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶兩步聯合酶提取其提取率為6.86%。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合酶提取其提取率為7.27%。

本實驗采用兩步聯合酶提對紫貽貝組多糖的提取工藝進行了優化，使粗多糖提取率得到大幅度的提高，其最佳提取條件為加酶量1%，料液比1:20 g/mL，木瓜蛋白酶最佳pH為7，堿性蛋白酶最佳pH為10，溫度為50℃。根據上述實驗可知，兩步聯合酶提比單酶提取效果好。且木瓜蛋白酶與中性蛋白酶兩步聯合酶提紫貽貝粗多糖與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶兩步聯合酶提相比，后者效果更佳。兩步聯合酶提法可大量、高效提取紫貽貝粗多糖，這對貽貝糖胺聚糖結構和抗腫瘤活性的研究及多糖配方食品和藥品的開發與研究具有重大意義。

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Study on Enzyme Extraction Technology of Polysaccharide from Common Mussel

HAN Ying,QU You-le
(Food and Mecical School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Polysaccharide from common mussel were extracted by papain,neutral protease,alkaline protease,papain combined with neutral protease and papain combined with alkaline to study the affections of enzyme dosage,solid-liquid ratio,pH and temperature on the extraction rate.The results showed that the best available data of papain was as follows:the optimal dosage of enzyme was 1%,the radio of raw material to solvent was 1:15 g/mL,the pH was 7 and the extraction temperature was 60℃.Under the conditions of extration, the rate of extraction was 6.65%.The best available data of neutral protease was as follows:the optimal dosage of enzyme was 2%,the radio of raw material to solvent was 1:15 g/mL,the pH was 7 and the extraction temperature was 50℃.Under the conditions of extration,the rate of extraction was 5.52%.The best available data of alkaline protease was as follows:the optimal dosage of enzyme was 2%,the radio of raw material to solvent was 1:15 g/mL,the pH was 10 and the extraction temperature was 50℃.Under the conditions of extration,the rate of extraction was 6.89%.The best available data of papain combined with neutral protease was as follows: the Optimal dosage of enzyme was 1%,the radio of raw material to solvent was 1:20 g/mL,the pH was 7 and the extraction temperature was 50℃.Under the conditions of extration,the rate of extraction was 6.86%.Thebest available data of papain combined with alkaline protease was as follows:the optimal dosage of enzyme was 1%,the radio of raw material to solvent was 1:20 g/mL,the pH of papain’s cushion fluid was 7,the pH of alkaline protease’s cushion fluid was 10 and the extraction temperature was 50℃.Under the conditions of extraction,the rate of extration was 7.27%.

common mussel;polysaccharide;the technology of extraction

S201.2+2

A

1008－830X(2016)05－0395－08

2016-08-01

浙江省科技廳項目（2010R50029-19）

韓瑩（1991-），女，山西大同人，碩士研究生，研究方向：天然產物的提取與應用.E-mail:535895863@qq.com

曲有樂，教授.E-mail:youle1960@sina.com