靶向血管內皮生長因子受體2超聲造影劑的制備及其體外尋靶能力實驗研究

袁海霞，湯 陽，汪瀚韜，孔文韜，王文平. 復旦大學附屬中山醫院超聲科，上海 0003；. 江蘇省南京鼓樓醫院超聲科，江蘇 南京 0008

靶向血管內皮生長因子受體2超聲造影劑的制備及其體外尋靶能力實驗研究

袁海霞1，湯 陽1，汪瀚韜1，孔文韜2，王文平1
1. 復旦大學附屬中山醫院超聲科，上海 200032；
2. 江蘇省南京鼓樓醫院超聲科，江蘇 南京 210008

目的：制備靶向血管內皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)超聲造影劑，評價其物理性質及對腫瘤細胞的尋靶能力。方法：利用生物素-親和素橋接法將微米級超聲造影劑USphere與VEGFR2抗體結合，制備靶向VEGFR2超聲造影劑，檢測其粒徑分布；用免疫熒光法檢測不同細胞株(高轉移肝腫瘤細胞MHCC-97H及正常肝細胞LO2)中VEGFR2表達強度，以及靶向與非靶向VEGFR2超聲造影劑對MHCC-97H和LO2細胞的結合能力。結果：靶向VEGFR2超聲造影劑微泡分布均勻，平均粒徑(1 012.67±78.59) nm，免疫熒光法顯示VEGFR2抗體可特異性連接于微泡表面。標記熒光的VEGFR2抗體在MHCC-97H細胞高表達，在LO2細胞低表達。免疫熒光定量顯示靶向VEGFR2造影劑在MHCC-97H細胞中的熒光強度比值(微泡熒光強度/細胞熒光強度)為0.75±0.32，顯著高于其他3組(P＜0.01)。結論：本研究成功制備靶向VEGFR2超聲造影劑，其大小穩定均一，可與高表達VEGFR2的MHCC-97H細胞特異性結合。

靶向超聲造影劑；生物素-親和素；血管內皮生長因子受體2；超聲分子成像；腫瘤血管生成

腫瘤生長和轉移過程中，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)起重要作用。血管內皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)在多種腫瘤新生血管內皮細胞表面高度表達，而在正常組織中低表達[1-4]。以VEGFR2為靶點，旨在減少腫瘤內血管生成，從而抑制腫瘤生長的靶向藥物已進入臨床使用階段[5-6]。目前，臨床上實體腫瘤療效的評價體系采用實體瘤療效評價新標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)及改良實體瘤療效評價標準(modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，mRECIST)。這些評價標準仍是基于腫瘤最大平面的長徑變化及腫瘤數目的多少來反映靶向治療對腫瘤是否有效，但在早期反映腫瘤病灶內血管生成改變方面有欠缺[7-9]。因此，臨床上迫切需要找到一種能早期、準確、無創反映腫瘤內微血管灌注變化的評價手段，從而更早發現腫瘤對治療是否應答。

Baetke等[10]將靶向VEGFR2微泡造影劑(BR55，Bracco公司)用于裸鼠皮下移植瘤模型顯像中，發現其可特異性顯示瘤內血流灌注改變。然而，這種商品化的靶向造影劑不利于轉換其他靶點進行后續研究。因此，本研究嘗試利用生物素-親和素法，將微米級超聲造影劑USphere與VEGFR2抗體結合，以期獲得一種制作簡便的靶向VEGFR2微泡造影劑，并對其粒徑分布及體外肝腫瘤細胞尋靶能力進行探討，為后續腫瘤治療監測提供研究基礎。

1 資料和方法

1.1 實驗材料

超聲造影劑USphere? Labeler購自臺灣博信生物科技公司，生物素化大鼠抗小鼠CD309 單抗、VEGFR2抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記小鼠抗大鼠IgG2a購自美國BioLegend公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate bufered saline，PBS)購自ThermoFisher Scientifc公司，Alexa fluor555購自美國Life Technology公司，DMEM培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司，青/鏈霉素溶液購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司。人高轉移肝癌細胞株MHCC-97H、正常肝細胞株LO2來自復旦大學附屬中山醫院肝病研究所。AM-1高速振蕩器為臺灣Monitex公司產品，低速離心機(3-18KS)為德國Sigma公司產品，納米粒度電位分析儀Nano ZS90為英國馬爾文儀器有限公司產品，激光共聚焦顯微鏡為日本Olympus公司產品。

1.2 靶向VEGFR2微泡造影劑的制備及理化性質測定

按USphere? Labeler說明書，將微泡溶液室溫下置于專用高速振蕩器內振蕩40 s活化。將活化后的微泡與生物素化VEGFR2單抗在室溫下混合15 min，混合比例根據產品說明書(0.7 nmol抗體/mL USphere? Labeler微泡)，1 000 r/min離心3 min，棄下清，PBS洗3次，獲得制備完成的靶向微泡。非靶向及靶向微泡懸液分別用PBS稀釋1 000倍，粒度分析儀測定微泡粒徑分布。VEGFR2抗體與FITC標記的熒光二抗4 ℃避光反應10 min，1 000 r/min離心3 min，棄上清，獲得熒光標記VEGFR2抗體。將該抗體與USphere微泡接靶并離心洗滌，棄下清，獲得熒光標記的靶向微泡。用PBS稀釋100倍后，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察微泡形態。

1.3 免疫熒光測定不同細胞株中VEGFR2的表達

在37 ℃、5% CO2孵箱中，用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素溶液的DMEM培養液培養人高轉移肝癌細胞株MHCC-97H和正常肝細胞株LO2，每 2～3 d傳代1次。收集對數生長期MHCC-97H、LO2細胞，消化離心，取200 uL 細胞懸液(1×105/mL細胞密度)接種于鋪有蓋玻片的12孔板中，加入DMEM培養液，于孵箱內培養過夜。第2天加入標記Alexa fuor555的VEGFR2單抗(1∶50稀釋)共孵育30 min，PBS洗3次，多聚甲醛固定，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，共聚焦顯微鏡下觀察不同細胞表達VEGFR2的熒光強度。

1.4 靶向造影劑體外尋靶能力

同1.3方法培養上述兩種細胞，接種于12孔板中，每種細胞接種4孔。分別加入標記FITC的靶向造影劑和非靶向造影劑(1∶20稀釋)，于培養箱中共孵育30 min，多聚甲醛固定，PBS洗3次，DAPI染色。共聚焦顯微鏡下觀察不同細胞表達FITC的熒光強度，20倍鏡下每孔于左上、左下、中央、右上、右下掃描拍片，ImageJ軟件分析熒光強度。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 靶向造影劑的理化性質

熒光顯微鏡下放大400倍，顯示FITC標記的靶向VEGFR2微泡呈彼此分散、較均勻的綠色透亮圓形空泡(圖1B)。粒徑分析結果顯示，新鮮配制的靶向微泡平均粒徑為(1 012.67±78.59 ) nm (n=3)。粒徑分布圖顯示，粒徑大小均一，離散度小(圖1 A) 。

圖1 靶向VEGFR2微泡粒徑分布圖及熒光顯微鏡下FITC標記的靶向VEGFR2微泡形態(×400)

2.2 免疫熒光檢測MHCC-97H和LO2細胞中VEGFR2表達強度

激光共聚焦熒光顯微鏡下放大400倍，顯示Alexa fuor555標記的紅色VEGFR2單抗與MHCC-97H細胞結合強度(圖2 A)明顯高于LO2細胞(圖2 B)(藍色部分為DAPI染色的細胞核)。表明VEGFR2在MHCC-97H細胞中高表達，而在正常肝細胞中低表達。

圖2 標記Alexa fluor555的VEGFR2抗體與MHCC-97H、LO2細胞結合的熒光照片(×400)

2.3 靶向造影劑對腫瘤細胞的尋靶能力

激光共聚焦熒光顯微鏡下，放大200倍，MHCC-97H細胞加靶向VEGFR2微泡組中，FITC標記的靶向微泡與DAPI染色的細胞核熒光比值(圖3 A)明顯高于其余3組(圖3 B、3 C、3 D)。熒光顯微鏡照片顯示，靶向VEGFR2微泡與MHCC-97H細胞共孵育后，MHCC-97H細胞周圍綠色熒光明顯多于其余3組，表明靶向VEGFR2微泡可特異性結合于高表達VEGFR2的MHCC-97H細胞表面。

圖3 MHCC-97H和LO2細胞與靶向、非靶向微泡結合熒光照片(熒光顯微鏡，×200)

用ImageJ軟件對靶向與非靶向VEGFR2微泡分別作用于MHCC-97H細胞及LO2細胞的圖像進行分析，計算FITC標記的靶向微泡熒光與DAPI標記的細胞核熒光的比值。結果顯示，靶向VEGFR2微泡與MHCC-97H細胞共孵育組中微泡與細胞核的熒光比值為0.75±0.32，與其余3組相比有統計學差異(P＜0.01) (圖4) 。

圖4 ImageJ軟件計算各組微泡熒光與細胞核熒光的比值

3 討 論

腫瘤發生發展及轉移過程中有多種機制參與。近年來，針對腫瘤治療的方法中，以抑制腫瘤血管生成、誘導細胞凋亡的靶向治療發展迅速。由于腫瘤的耐藥性及個體差異，臨床需一種能早期發現治療有效性的評估手段。影像學評估標準RECIST 及mRECIST根據腫瘤體積或病灶數量的變化來監測實體腫瘤治療的療效，缺點是無法在腫瘤大小發生變化之前反映腫瘤內血流灌注強度的改變。本研究探討了一種靶向VEGFR2的微米級超聲微泡在評估腫瘤血管生成中的作用。微米級超聲造影劑因大小限制，不能通過腫瘤血管內皮間隙，可通過血液循環主動靶向于腫瘤血管內皮VEGFR2，從而實現腫瘤的特異顯像或藥物的定向釋放功能。

超聲造影劑結合配體的方法主要有吸附法、摻入法、交聯法和抗體衍生法[11-12]。生物素-親和素橋接法作為最常用的制作靶向微泡造影劑的方法之一，具有簡便、穩定、敏感、多靶點、結合率高等優勢[13-14]。本研究采用這一方法，將商品化的USphere超聲造影劑與VEGFR2單抗結合，成功制備了以腫瘤血管內皮細胞表面VEGFR2為靶點的超聲造影劑，熒光顯微鏡顯示微泡大小均一，均值在1 012.67 nm，無聚集，可用于后續超聲特異顯像。USphere超聲造影劑活化簡便，活化前可長期存儲，親和素化的結構使其外接VEGFR2抗體簡單易行，且可重復性和穩定性強。這些均為后續動物體內顯像研究及靶向其他特異腫瘤靶點提供了良好的材料學基礎。

肝癌靶向治療以索拉菲尼和貝伐單抗為代表[15-17]。腫瘤細胞中VEGFR2表達高于正常肝細胞。本研究選擇人高轉移肝腫瘤細胞株MHCC-97H和正常肝細胞株LO2進行對照，結果與文獻報道相符，證實MHCC-97H細胞內VEGFR2表達顯著高于正常肝細胞LO2[18]。進一步的靶向微泡實驗顯示，靶向VEGFR2微泡與高表達VEGFR2的MHCC-97H細胞結合能力顯著強于非靶向造影劑組及正常肝細胞LO2組。超聲造影是通過接收微泡造影劑的背向散射信號進行顯像，配合定量分析技術，可嘗試在動物體內檢測腫瘤內與正常肝實質內超聲強度及定量指標的差異，來反映腫瘤內血流灌注的改變。針對細胞的靶向微泡結合實驗結果可作為動物體內實驗的研究基礎。

本研究存在一定的局限性。如靶向造影劑的內徑約1 μm，在正常情況下無法穿過腫瘤血管內皮間隙，因此仍屬于血池造影劑，無法對直接靶向腫瘤細胞進行顯像或載藥治療[19-20]。然而，本研究旨在評估腫瘤血管灌注，用該靶向造影劑特異反映腫瘤內皮細胞生長狀態改變的目的是可以達到的。本研究結果可作為靶向腫瘤血管內皮的特異性顯像及治療的研究基礎，早期反映腫瘤血管內皮生成變化，從而建立一種新的超聲造影定量評價靶向治療的體系。此外，在后續實驗中也可考慮將這種造影劑外接其他單抗，用于不同腫瘤的特異顯像。

綜上所述，本研究成功制備了一種靶向VEGFR2微泡造影劑，方法簡便，微泡大小均一穩定，能特異性地與高表達VEGFR2的MHCC-97H細胞高度結合，可作為一種較可靠的監測腫瘤血管內皮VEGFR2表達的分子影像學探針。

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Preparation of vascular endothelial growth factor receptor 2-targeted ultrasonic contrast agent and its ability of targeting tumor cells in vitro

YUAN Haixia1, TANG Yang1, WANG Hantao1, KONG Wentao2, WANG Wenping1
(1. Department of Ultrasound, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Ultrasound, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China)

WANG Wenping E-mail: puguang61@126.com

Objective:To evaluate the targeting ability of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2)-targeted microbubbles to tumor cells and its preparation process.Methods:VEGFR2-targeted microbubbles were accomplished by biotinavidin linkage of VEGFR2 antibody and USphere ultrasonic contrast agent. The features were detected by dynamic light scattering (DLS) and laser scanning confocal microscope (LSCM). The VEGFR2 expression intensities in MHCC-97H cells (high metastatic human hepatic carcinoma cells) and LO2 cells (human liver cells) were compared by immunofuorescence method. The combination rates of VEGFR2-targeted microbubbles and non-targeted micro bubbles with both cell lines were documented by quantitative immunofluorescence technique.Results:VEGFR2-targeted microbubbles were distributed evenly with average particle size of (1 012.67±78.59) nm. Immunofuorescence assay showed green fuorescence visible on the surface of the targeted micro bubbles. The immunofuorescence signal was higher in MHCC-97H cells than that in LO2 cells. The fuorescence signal ratio of VEGFR2-targeted microbubbles was (0.75±0.32) in MHCC-97H cells, which was signifcantly higher than that in other three groups (P＜0.01).Conclusion:VEGFR2-targeted microbubbles with a stable average size are successfully prepared. The micro bubbles could specifcally combind with VEGFR2-high-expressing MHCC-97H cells.

Targeted ultrasonic contrast agent; Biotin-advidin; Vascular endothelial growth factor receptor 2; Molecular ultrasound imaging; Tumor angiogenesis

R445.1

A

1008-617X(2016)04-0322-05

2016-11-17

2016-12-11）

國家自然科學基金資助項目(No：81371577；81571676)

王文平 E-mail：puguang61@126.com