c-fos基因在麻醉藥麻醉機理研究中的應用

■文/貴州大學動物科學學院 劉金平

c-fos基因在麻醉藥麻醉機理研究中的應用

■文/貴州大學動物科學學院 劉金平

c-fos基因是一種存在于正常神經核內的原癌基因，具有高度保守性。c-fos基因當機體受到外界刺激時，c-fos基因便迅速表達，通過轉錄和翻譯等一系列過程形成Fos蛋白。麻醉藥的使用會影響中樞神經系統中c-fos基因的表達，可以根據c-fos基因的轉錄和翻譯情況從基因和蛋白質的水平研究麻醉藥的麻醉機理，這為麻醉藥的研究提供了一個思路。

c-fos基因；Fos蛋白；獸用麻醉藥

C-fos基因的研究可以追溯到20世紀80年代中后期，它是FBJ和FBR小鼠肉瘤病毒(MSVs)中病毒癌基因v-fos細胞同源序列。通過基因比對發現，人與小鼠的相同序列高達94%，非常保守。人的c-fos基因位于14q16～31，是一個包含4個外顯子和3個內含子的DNA片段，其長度為9kb[1,2]。在受到外界刺激時，c-fos基因可轉錄為mRNA c-fos，進一步翻譯為Fos蛋白。根據c-fos基因的特點建立了c-fos技術，就是利用機體受到刺激時c-fos基因表達量迅速增加和產物Fos蛋白堆積于細胞核內的特點，采用原位雜交、免疫組化和蛋白印跡等方法來研究神經元功能的技術。

隨著畜牧業的快速發展，獸用麻醉藥使用逐漸普遍。獸醫臨床手術中的應用最為常見，其能夠減少動物在治療過程中的痛苦，同時使動物處于安靜狀態，方便醫務人員進行治療[3]；麻醉藥為野生動物體格檢查和日常管理提供方便[4]；近年來，麻醉藥應用于魚類保活運輸中，在長距離長時間運輸過程中，外界的應激會導致肉質損傷[5]，甚至出現魚類的死亡，合理地使用麻醉藥可以降低魚類的應激，減少魚類的死亡率，MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽)已被美國國家食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準為漁用麻醉劑[6]，丁香酚作為一種麻醉劑，因具有價格低廉、對人體健康無害、休藥期短、不會誘發機體產生突變物質等優點也被廣泛應用在魚類的運輸中[7]。

麻醉藥的使用帶來諸多好處，掌握麻醉藥在機體內的作用機理是麻醉藥臨床使用的前提，這可以為臨床使用中出現意外提供合理解決方案。近年來，對獸用麻醉藥作用機理的研究主要分為動物行為水平的研究、基因水平的研究、蛋白水平的研究等，本文就麻醉藥使用后c-fos基因的表達情況進行探討和分析。

1 c-fos基因

原癌基因家族中，有一類基因能夠接收第二信使的信號，使細胞外刺激信號轉化為調節細胞核內基因表達的信號，進行核內蛋白的編碼，調節下游基因的表達，從而影響細胞結構、功能的改變，這類基因被稱為“即刻早期基因”(immediate early gene，EG)，是目前較為理想的腦功能活動的定位標記[8]。這類基因在正常生理情況下表達量很少，但當機體受到外界刺激時能迅速表達、堆積形成蛋白，可以通過原位雜交或免疫組化等技術來進行研究。目前已發現的EG有十幾種，按它們的結構和功能特征大致分為c-fos家族、c-jun家族、c-myc家族和egr家族[9]。目前研究比較多的是c-fos基因和c-jun基因。

c-fos基因普遍存在動物體內各組織器官中，且中樞神經系統分布最為廣泛，參與腦各種活動的信號轉導和調控過程[10]。具體的調節機制如下：第一類，Ca2+-鈣調蛋白介導的信號轉導途徑、cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)磷酸化激活途徑、甘油二酯依賴的蛋白激酶C(PKC)途徑[11]；第二類，興奮性氨基酸(EAA)受體和G-蛋白偶聯受體(速激肽、腎上腺素能和α-MSH受體)誘導途徑[12]；第三類，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體激活途徑[13]；第四類，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑[14]。

2 Fos蛋白

Fos蛋白是c-fos基因轉錄、翻譯的產物。機體受到外界刺激時，c-fos基因被迅速激活轉錄形成c-fos mRNA，可在刺激30～45min達高峰期，12min為半衰期，編碼形成由380個氨基酸組成的核內蛋白Fos，Fos蛋白可在刺激20～90min檢測出來，60～90min達高峰期，持續時間為2～5h，半衰期為2h[15]。形成的FOS蛋白經過一系列過程完成細胞核內信號的轉導，因此被稱為核內“第三信使”[16]。

中樞Fos蛋白具有多種功能，常被用作神經元激活的標志。①FOS蛋白參與機體細胞的正常分化、生長以及中樞的學習、記憶等過程；②藥物研究方面，目前已經有研究表明FOS蛋白的表達可以用于偏頭痛、麻醉等種類藥物的篩選、用藥后的藥效評價和疾病發病機理研究模型的建立；③在臨床上，通常作為提示腦部受傷時間的參考指標，當腦部受傷時，根據FOS蛋白堆積的數量可以判斷受傷時間；④FOS蛋白的表達還是細胞終末分化的標志及發生死亡的先兆[17]。總的來說，Fos蛋白的表達可以用于各個方面的研究，為科研工作者在蛋白水平的研究提供了一個思路。

3 麻醉藥作用機理的研究概況

全麻藥的作用機理有很多種說法，比較多的是“脂質學說”、“蛋白質學說”、“突觸學說”等。近來的研究表明，全麻藥的作用機理是多機制、多效應、多部位和多靶點的共同作用[18]，藥物進入機體選擇性的作用于中樞神經系統的不同部位或神經通路，主要的作用靶點包括受體、離子通道、酶等[19]，研究較多的NMDA受體[20]、神經煙堿受體[21]、GABA A受體[22～25]等，中樞神經系統cAMP信號轉導通路、中樞神經系統NO-cGMP信號轉導通路等，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等。而對于局麻藥和靜脈麻醉藥的作用機理還不太清楚，有待進一步研究。

4 c-fos基因在麻醉藥作用機理中的研究概況

在麻醉藥作用機理的研究中，c-fos基因已有較多報道。楊軍等[26]在異丙酚麻醉大鼠實驗中，運用反轉錄-聚合酶聯反應(RT-PCR)和蛋白印跡技術(Western Blot)分析異丙酚對大鼠中樞神經系統海馬各區c-fos、c-jun基因及蛋白表達的影響中發現，注射異丙酚后，大鼠的海馬CA1區和DG區c-fos、c-jun基因和蛋白的表達水平顯著升高，且隨著異丙酚濃度的增加其升高趨勢越明顯，而海馬CA3區未發現異丙酚對c-fos、c-jun基因和蛋白表達水平的影響，最終得出異丙酚可能通過影響c-fos、c-jun基因的轉錄和翻譯，從而抑制中樞神經系統的作用實現麻醉功能，且此作用部位具有顯著差異性。李小波[27]研究表明，小型豬復合麻醉劑及塞拉嗪對大鼠的大腦皮層、丘腦、腦干、小腦、海馬5個腦區c-fos mRNA的表達有上調作用，從而推斷5個腦區可能是麻醉藥的作用部位，誘導c-fos mRNA的表達可能是小型豬復合麻醉劑及賽拉嗪的作用機制之一。孫凱[15]通過給大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚發現，中樞神經系統內不同腦區Fos蛋白的表達發生變化，呈現劑量依賴性，推測異丙酚的麻醉作用可能與Fos蛋白有關，具體有待進一步研究。尹柏雙等[29]給大鼠腹腔注射小型豬特異性麻醉劑(XFM)的拮抗劑阿替美唑，研究阿替美唑對大鼠催醒與c-fos基因的關系得出結論，中樞神經系統的c-fos基因參與XFM麻醉作用，拮抗劑阿替美唑誘導大腦皮層Fos蛋白的表達，可能是阿替美唑催醒XFM麻醉大鼠的重要機理之一。

5 c-fos基因在麻醉藥作用機理中的研究展望

c-fos基因可以作為臨床藥物研究的觀察指標，同時提供了藥物研究的一些新思路。不管麻醉藥的作用對c-fos基因的表達是抑制作用還是促進作用，都可以從兩個不同的層面去思考麻醉機理。一是從c-fos mRNA方面，提取總mRNA，通過逆轉錄得到cDNA，運用RT-PCR得到擴增曲線和溶解曲線，比較麻醉前后c-fos mRNA的表達量，找出麻醉藥對c-fos mRNA表達起抑制還是表達作用，再討論麻醉藥的作用機理。二是從Fos蛋白方面。目前這方面的研究已有報道，一些麻醉藥使用后會促進Fos蛋白的形成，這時可以直接利用免疫組化或原位雜交技術確定Fos蛋白的表達量，也有一些麻醉藥會抑制Fos蛋白的表達，這時可以借助外界刺激使Fos蛋白表達增加，一定時間后使用麻醉藥，用上述的方法看麻醉藥對Fos蛋白的抑制作用，分析麻醉藥的作用機理。

根據上述兩個方面的研究，麻醉藥的作用機理存在兩種可能性。①可能直接影響c-fos基因的表達，而如何影響c-fos基因的表達，c-fos又是如何發揮麻醉鎮痛作用，這將是以后麻醉藥作用機理研究的一個方向。②可能作用于某一受體，然后影響c-fos基因的表達，這時可以利用受體的激動劑或拮抗劑控制麻醉藥的作用，觀察c-fos基因的表達情況，當使用某一受體的激動劑或拮抗劑，c-fos基因的表達量發生變化時，就可以推測該麻醉藥可能是作用于這一受體，具體如何作用還需進一步探討。

6 結語

c-fos基因在獸用麻醉藥麻醉過程中發揮重要作用，但c-fos基因如何參與麻醉過程、麻醉藥物對中樞神經系統c-fos基因表達影響的具體機理等報道較少，沒有形成系統的、清晰的思路，因此從c-fos基因方面研究獸用麻醉藥的作用機理具有重要意義。明確麻醉藥的具體作用機理，是研發一種新型麻醉藥的必需過程，同時為尋找麻醉藥合適的激動劑和拮抗劑提供幫助，激動劑和拮抗劑的使用可以更好地控制藥物效果和作用時間長短；預防麻醉藥使用過程中遇到的突發狀況，提前制定合理方案。■

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