DNA Taq酶與其在PCR技術中的應用

● 周怡章 王玉姣 張天宇

DNA Taq酶與其在PCR技術中的應用

● 周怡章 王玉姣 張天宇

從水生嗜熱菌菌株中分離出的TaqDNA聚合酶，具有熱穩定性、忠實性、離子依賴性以及對抑制劑敏感等特點，較其他聚合酶更適用于PCR技術，所以被廣泛應用于PCR技術。另外，部分研究人員也研制出了TaqDNA聚合酶的實驗室制備方法。

DNATaq酶 PCR技術 熱穩定性

1 發現與命名

最初在實驗中進行DNA片段擴增時，使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐熱、易鈍化，DNA模板在進行熱變性時，每次加入的酶只能進行一個擴增反應周期，這使得PCR技術的操作程序十分繁瑣。

隨后，有實驗人員把Klenow酶替換為T4DNA聚合酶進行基因擴增。這種改良使得PCR的程序有所精簡，擴增出的DNA片段均一性、真實性相對較高，但仍無法解決PCR技術的自動循環的問題。

后來，在美國黃石國家森林公園的溫泉中，研究者成功地發現并提取到生長溫度為70-75°C的嗜熱桿菌。該菌株內含有60-68kDa的DNA聚合酶，其比活性為2000-8000U/mg，這引起了研究人員的注意。在對其進行深度研究后，研究人員又注意到另一種水生嗜熱桿菌Thermus aquaticus（YTI），他們在這種嗜熱桿菌中分離出一種93910Da的耐熱性DNA聚合酶，其比活性為200000U/mg，該酶具有熱穩定性、忠實性、離子依賴性以及對抑制劑敏感的特點，適合應用于PCR過程，故研究人員將此耐熱性DNA聚合酶命名為TaqDNA聚合酶（TaqDNA Polymerase）。TaqDNA聚合酶的發現使得PCR逐漸被普及。

2 特點

聚合酶的基因全長2496bp，共編碼832個氨基酸，其分子量為94KDa，比活性為200000單位/毫克。

1）熱穩定性和酶活性：聚合酶的熱穩定性是其用于PCR反應的前提，也是使PCR反應被廣泛應用的重要原因。在75～80℃的條件下，每個聚合酶每秒可延伸大約150個核苷酸。然而在70℃時，每秒其延伸的核苷酸數量為60個左右；55℃時，其延伸速度更低，為24個核苷酸/秒。所以，溫度過高(90℃及以上)或過低(22℃及以下)都可能影響到聚合酶的活性。由于聚合酶具有良好的熱穩定性，其在PCR過程的高溫中仍可保持較高的活性。在92.5℃、95℃、97.5℃時，PCR混合物中的聚合酶分別經130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性。

2）離子依賴性： 聚合酶是 鎂離子依賴性酶，其催化活性受Mg2+濃度影響。在PCR 反應液中，Mg2+會與dNTP結合而影響其游離濃度，因而應根據不同要求適當調整 MgCl2濃度。通常情況下，Mg2+濃度需比 dNTP總濃度需至少高 0.5～1.0mmol/L。另外，氯化鉀的濃度也會影響 聚合酶的催化效能。在PCR 反應液中，氯化鉀最適濃度為 50mmol/L。在該濃度下聚合酶的催化效率可提高 50～60%，但氯化鉀濃度高于75mmol/L時該酶的活性明顯被抑制。[1]

3）忠實性：聚合酶具有聚合酶活性和 外切酶活性，而無外切酶活性，也不具有的校對活性。故在 PCR 反應中發生的部分堿基錯配是不會被該酶校正的。有研究表明， 聚合酶的堿基錯配機率約為 2.1×10-4。

4）抑制劑：甲酰胺、低濃度的尿素、二甲基亞砜(DMSD)和二甲基甲酰胺(DMF)對 聚合酶的催化作用無影響。極低濃度的離子表面活性劑如脫氧膽胺酸鈉(小于0.06%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，小于0.01%)、十二烷基肌氨酸鈉(小于0.02%)幾乎可完全抑制該酶活性。而非離子表面活性劑，如：Tween20，NP-40和Tritox-100，在相對高濃度時可抑制該酶活性。[2]

3 制備和提取

由于Thermus aquaticus水生嗜熱桿菌培養較困難、產量較低，目前大部分實驗室多使用商品化的TaqDNA聚合酶。但目前也有研究人員研制出了實驗室制備方法，并已證實可有效擴增。

含有TaqDNA聚合酶基因的pTaq表達質粒轉化大腸桿菌 E.coli菌株可在異丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)誘導10 -12h后表達耐熱性TaqDNA聚合酶。表達出該酶后使用溶菌酶、NP40裂解細菌，再進一步在4℃下使用硫酸銨沉淀后透析。制備的TaqDNA聚合酶可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、考馬斯亮藍法和 PCR等方法確定其純度、濃度和活性。[3]

4 應用與前景

耐熱性TaqDNA聚合酶的發現對于PCR技術的廣泛應用有重大意義。聚合酶鏈式反應（即PCR）為在體外95°C高溫條件下，DNA變性轉化為單鏈，降低溫度（通常約60°C）后引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，進一步調節溫度至DNA聚合酶的最適反應溫度（即72°C左右）后，DNA聚合酶沿的方向合成互補鏈。如今，在臨床工作中PCR技術也得到了應用。PCR在檢驗學中最有意義的部分是對感染性疾病的診斷。另外PCR技術可檢測基因突變和癌基因的表達量，對腫瘤早期診斷、分型、分期和預后判斷有重要意義。

（作者單位：山西醫科大學第二臨床醫學院）

[1]丁燕華,劉樹濤,齊慶遠等.Taq DNA聚合酶的熱純化制備[J].農業科學與技術(英文版),2011,12(3):375-378

[2]王天云,秦川,楊瑞等.基因重組TaqDNA酶的制備.新鄉醫學院學報,2007,24(6):551-553

[3]肖朝文,杜鵑,李晚忱.Taq DNA聚合酶制備技術的優化[J].四川農業大學學報,2002,22(4):318-321