葡萄多倍體育種成果及影響因素概述

溫曉敏，張娜，月丫，田淑芬*

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

葡萄多倍體育種成果及影響因素概述

溫曉敏1,2，張娜1，月丫1,2，田淑芬1*

（1. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

我國近20年通過審定且確定倍性的葡萄新品種中，共有5個通過雜交方法培育出的三倍體葡萄新品種，14個雜交育成的四倍體葡萄新品種，4個通過芽變選育得到的四倍體葡萄新品種，4個實生選育出的四倍體葡萄新品種，4個秋水仙素誘變而來的四倍體葡萄新品種。三倍體雜交育種和四倍體誘變育種效率較低，概述了近年來對三倍體胚挽救雜交育種和四倍體秋水仙素誘變育種影響因素的研究。綜述了育成種質(zhì)的鑒定評價方法和意義，對今后有望培育兼具大粒、無核、香味等優(yōu)良性狀的多倍體葡萄新品種進行了展望。

多倍體；葡萄；新品種；育種方法；影響因素；種質(zhì)評價

葡萄是無性繁殖的多年生樹種，能將多倍體的優(yōu)良性狀穩(wěn)定地遺傳下去，進而克服了多倍體育性差無法大量用于生產(chǎn)的缺點[1]。同時多倍體葡萄具有莖粗、節(jié)間短、果粒巨大、同化物質(zhì)含量高、種子少等優(yōu)點，特別是三倍體葡萄，因其大多數(shù)高度不育，所以果實無核或少核[2]。以上優(yōu)點使得葡萄多倍體育種研究更具意義[3]。目前育成的多倍體葡萄主要是三倍體和四倍體。本文分別對三倍體、四倍體的育種方法，近年來育種成果、影響因素及育成種質(zhì)的評價做了綜述。旨在為了解近期多倍體育種情況及多倍體育種工作提供參考。

1 葡萄多倍體育種

三倍體葡萄由于果實無核或少核，使得三倍體育種成為無核品種選育的主要途徑之一。四倍體葡萄具有果粒大、營養(yǎng)物質(zhì)含量高的優(yōu)點，四倍體育種是培育大粒葡萄的育種方法。三倍體與四倍體育種符合當(dāng)前大粒、無核的主要葡萄育種目標(biāo)。雜交育種是葡萄多倍體育種的常規(guī)方法[4]。育成的優(yōu)良品種約有68%為雜交方法育成的[5]。

1.1 三倍體葡萄育種

目前無核三倍體育種的主要途徑包括：二倍體與四倍體間正反交、胚乳培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、對自然突變的選擇等[3]。花藥培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)獲得多倍體成功率低，實用性差。最常用的三倍體育種方法即雜交育種。

蔣愛麗等[6-7]用二倍體“希姆勞特”分別與四倍體“藤稔”和“巨峰”雜交選育出了三倍體無核葡萄品種“滬培3號”和“滬培1號”。趙勝建等[8-10]用二倍體“鄭州早紅”和四倍體“巨峰”雜交育成了三倍體葡萄新品種“無核早紅”和“紅標(biāo)無核”，用“玫瑰香”和“巨峰”雜交育成三倍體品種“月光無核”。

1.2 四倍體葡萄育種

四倍體育種的主要方法包括有性雜交、人工誘變、對自然變異的選擇等[1]。

1.2.1四倍體雜交育種

四倍體葡萄雜交是獲得四倍體新品種的最主要途徑，己選育出許多四倍體新品種。如近年來我國審定的雜交四倍體葡萄新品種有“玫香寶”（阿登納玫瑰×巨峰）[11]、“光輝”（香悅×京亞）[12]、“申華”（京亞×優(yōu)系86-179）[13]、“申玉”（藤稔×紅后）[14]、“申豐”（京亞×紫珍香）[15]、“蜜紅”（沈陽玫瑰×黑奧林）[16]、“巨玫瑰”（沈陽大粒玫瑰香×巨峰）[17]、“黑玫香”（沈陽大粒玫瑰香×巨峰）[18]、“春光”（巨峰×早黑寶）、“蜜光”（巨峰×早黑寶）、“峰光”（巨峰×玫瑰香）、“寶光”（巨峰×早黑寶）[19]、“玉波一號”（紫地球×達米娜）、“玉波二號”（紫地球×達米娜）[20]。

1.2.2通過對自然芽變的篩選獲得葡萄四倍體新品種

二倍體葡萄自然突變產(chǎn)生多倍體的途徑分為三類[21]：合子或體細胞加倍、配子加倍和體細胞融合。此外，多倍體也可產(chǎn)生新的變異[22]。芽變屬于體細胞的變異，芽變產(chǎn)生三倍體的發(fā)現(xiàn)較少，更多的是發(fā)現(xiàn)二倍體芽變成的四倍體和四倍體變異產(chǎn)生新的四倍體。選擇四倍體的優(yōu)良芽變是改良葡萄品種的重要途徑之一。2010年以來審定的芽變品種，已鑒定其為四倍體的有：“紅地球”的芽變“紅太陽”[23]、“禮泉超紅”[24]，“巨峰”的芽變“峰早”[25]、“宇選1號”[26]。異常的環(huán)境更易誘導(dǎo)突變，自然突變是自然發(fā)生的，不受人為控制。通過自然芽變篩選培育葡萄多倍體新品種，速度緩慢，隨機性大[27]。

1.2.3通過實生選育獲得葡萄四倍體新品種

依據(jù)葡萄實生選育種間變異較大的原理[28]通過對葡萄實生播種，從中選育出性狀優(yōu)良的葡萄品種。近年來從“巨峰”實生系中選育出了四倍體葡萄新品種“申寶”[29]、“貴園”[30]、“峰后”[31]；用“甲裴露”實生播種選育出了四倍體葡萄新品種“紅十月”[28]。通過播種進行有性繁殖，利用葡萄種子間可能的變異，可增加多倍體新品種產(chǎn)生可能性。

1.2.4人工誘變培育葡萄四倍體新品種

多倍體不僅可以自然發(fā)生，也可以通過人工誘變，人工誘導(dǎo)植物多倍體的方法分為物理法和化學(xué)法。

物理方法主要有切傷、摘心、嫁接、改變溫度。反復(fù)切傷和摘心會產(chǎn)生多倍體的原因在于反復(fù)切傷、摘心刺激細胞分裂，細胞核分裂速度較細胞分裂速度快，于是在細胞內(nèi)形成雙核或多核，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體；同理嫁接時在愈合處也易形成染色體加倍枝條；改變溫度形成多倍體的原因在于當(dāng)溫度過高或過低會阻礙細胞正常分裂[27]。除此之外還包括X射線、離心力等物理誘變方法，但效率較低。物理法誘變的葡萄新品種較少，近幾年育成的葡萄新品種，如：“瑞都紅玉”葡萄為“瑞都香玉”(京秀×香妃)高接時發(fā)生的紅色芽變[32]。

化學(xué)方法主要用秋水仙素處理植物分裂旺盛部位，是人工誘導(dǎo)植物多倍體的最有效方法[33]。秋水仙素可以抑制有絲分裂前期紡錘體的形成，無法牽引染色體均分到細胞兩極而使染色體加倍。石雪暉等[34]以萌發(fā)的刺葡萄種子為試材，用秋水仙素化學(xué)誘導(dǎo)選育出了刺葡萄四倍體新品種“湘釀1號”。常將雜交育種與誘變育種相結(jié)合，進行葡萄新品種選育，如“瑰寶”與“秋紅”雜交后經(jīng)秋水仙素誘變選育出四倍體新品種“晚紅寶”[25]、“秋黑寶”[35]；以“瑰寶”與“早玫瑰”的雜交種子用秋水仙素誘變育成的四倍體葡萄新品種“早黑寶”[36]。還可用異生長素等對植物進行誘變，但效率極低，成功率一般小于5%[27]。

2 葡萄多倍體育種影響因素

目前我國育成多倍體葡萄品種多為四倍體，三倍體育種效率不高。有必要對其育種方法及影響因素進行總結(jié)，為多倍體育種效率的提高提供參考。

2.1 三倍體雜交育種影響因素

雜交培育三倍體，由于不同倍性間雜交障礙，胚敗育嚴(yán)重，因此需要通過胚挽救技術(shù)在胚敗育之前進行離體胚挽救，從而提高雜交后代獲得率。胚挽救雜交育種的一般流程為：花粉采集→去雄授粉→取樣消毒并剝?nèi)∨咧椤咧榕囵B(yǎng)（胚發(fā)育）→剝胚→胚萌發(fā)培養(yǎng)→胚成苗培養(yǎng)→繼代培養(yǎng)→煉苗移栽[37-38]。

為提高胚挽救成功率，需對胚挽救各階段影響因素進行優(yōu)化。雜交組合的選擇，取樣時間，培養(yǎng)基種類，光、溫等培養(yǎng)條件，胚萌發(fā)培養(yǎng)時間，胚珠處理方式等對胚挽救效果影響重大。徐海英[39]證明了胚挽救是克服胚敗育的有效途徑。普遍認(rèn)為不同雜交組合最佳取樣期不同，且與母本成熟期密切相關(guān)[39-41]。關(guān)于胚發(fā)育培養(yǎng)，唐冬梅[41]認(rèn)為固液雙相Nitsch＋GA30.5 mg/L＋IAA 1.5 mg/L和MM3培養(yǎng)基最適宜于無核葡萄離體幼胚的發(fā)育，低溫會降低胚發(fā)育率；暗培養(yǎng)有利于幼胚的發(fā)育。而郭印山等[42]認(rèn)為二倍體與四倍體雜交胚在無機鹽濃度較低的White培養(yǎng)基上更有利于胚發(fā)育。王素月[40]研究表明在1/2MS＋IAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上有利于胚萌發(fā)；剝?nèi)÷闩呙劝l(fā)快，且成苗率高。

2.2 四倍體秋水仙素誘變育種影響因素

用秋水仙素誘導(dǎo)葡萄多倍體時，影響誘變率的因素有處理材料的生長狀態(tài)、秋水仙素濃度和處理時間[4]。羅耀武等[43]用0.2%秋水仙素溶液處理“玫瑰香”葡萄植株的生長點45 h，獲得了四倍體“玫瑰香”。張丙秀等[44]探索了秋水仙素濃度及不同處理方法對“京秀”葡萄變異的影響，研究表明對于浸泡單芽莖段法，濃度的影響強于處理時間，最佳誘導(dǎo)濃度及時間為 0.3%處理 24 h；而對于混培法，處理時間的影響卻強于濃度，最佳誘導(dǎo)濃度及時間為2000 mg/L處理 30 d。在離體誘變研究，張淑愛等[45]在0.1%秋水仙素溶液中浸泡葡萄試管苗莖段6 h，再扦插在不含秋水仙素的B5培養(yǎng)基中，獲得根尖加倍的四倍體“里扎馬特”和長粒“無核白”。盧炳芝等[46]用“勝利”葡萄品種帶花藥的花絲誘導(dǎo)胚狀體,然后用0.2%秋水仙素浸泡胚狀體5 d，獲得同質(zhì)變異的四倍體。這些方法需經(jīng)組織培養(yǎng)，對于有核的葡萄品種，以種子為材料誘導(dǎo)加倍，可直接得到加倍植株。

陳俊[47]采用種子浸漬法處理“瑰寶”葡萄天然授粉種子，待催芽4 d后胚莖伸長1 cm左右時，分別用0.2%和0.4%的秋水仙素溶液處理,均獲得了同質(zhì)四倍體。閆愛玲等[48]研究表明當(dāng)未名玫瑰種子胚根長1.0 cm時，用0.5%秋水仙素處理96 h，其成活率和四倍體率較高分別為11.33%和5.12%。

3 育成葡萄種質(zhì)鑒定評價

育種后首先應(yīng)進行早期倍性鑒定，以提高育種效率。定植田間后應(yīng)調(diào)查性狀，以便篩選優(yōu)良種質(zhì)進一步擴繁、純化、審定、推廣，以及進一步用于新品種的培育。

3.1 倍性鑒定

倍性鑒定最準(zhǔn)確常用的方法為染色體計數(shù)法和流式細胞儀倍性分析法，其他如：減數(shù)分裂觀察法、形態(tài)學(xué)鑒定法、解剖學(xué)鑒定法、生理生化指標(biāo)鑒定法、同工酶電泳譜帶的特征法等可作為輔助鑒定方法。

3.1.1染色體計數(shù)法

倍性鑒定最直接的方法就是染色體計數(shù)法。染色體計數(shù)法以根尖、幼芽、幼葉、莖尖、卷須為材料[49]，根據(jù)材料不同各步驟略有不同。王小利[50]發(fā)現(xiàn)以葡萄根尖為試材，壓片成功率最高。錢春[51]在白香蕉葡萄芽變突變體鑒定中，首先采用根尖做試驗材料進行初步鑒定，然后對卷須進行連續(xù)鑒定，避免了只是根部加倍而地上部不加倍的現(xiàn)象。

染色體計數(shù)法包括常規(guī)壓片法和去壁低滲法[52]。常規(guī)壓片法需掌握好酸解時間，去壁低滲法需控制好低滲處理和酶解時間。對于儲藏物質(zhì)多的幼芽、幼葉、莖尖、卷須宜采用去壁低滲法，對于根尖采用常規(guī)壓片法較簡便[53]。郭印山[37]用常規(guī)壓片法對根尖進行了染色體倍性鑒定。常金華[54]運用去壁低滲法對人工誘變的四倍體“玫瑰香”葡萄卷須的染色體進行計數(shù)，來確定倍性。孫馬[55]用去壁低滲染色體計數(shù)法對部分中國野生葡萄的幼葉和幼芽進行了倍性鑒定。

3.1.2流式細胞儀倍性分析

對于染色體數(shù)目較多的材料，染色體計數(shù)法鑒定較困難。可利用流式細胞光度術(shù)（FCM）測定細胞核DNA含量鑒定材料倍性[56-60]。流式細胞儀的問世為植物染色體倍性的研究提供了一條便捷的途徑，其鑒定快速方便，且準(zhǔn)確性較高[60]。郭印山[37]、張丙秀[44]、趙艷華[60]等利用流式細胞儀分別對葡萄進行了倍性鑒定。

3.2 性狀調(diào)查

3.2.1物候期調(diào)查

調(diào)查物候期為評價葡萄經(jīng)濟性狀提供了依據(jù)，為葡萄新品種的引種栽培管理提供參考。一般調(diào)查葡萄萌芽始期、開花始期、開花盛期、漿果開始生長期、漿果始熟期、漿果完熟期、新梢開始成熟期等。三倍體葡萄“無核早紅”[8]、“紅標(biāo)無核”[9]為極早熟品種，四倍體“紅十月”[28]為極晚熟品種。其他：“玫香寶”[11]、“光輝”[12]、“申華”[13]、“貴園”[30]、“宇選1號”[26]、“峰早”[25]、“早黑寶”[36]為早熟品種；“滬培1號”[7]、“黑玫香”[18]、“申豐”[15]、“巨玫瑰”[17]、“蜜光”[19]為中早熟品種；“滬培3號”[6]、“峰光”、“寶光”[19]、“申寶”[29]、“秋黑寶”[35]為中熟品種；“玉波一號”、“玉波二號”[20]、“申玉”[14]、“峰后”[31]為中晚熟品種；“禮泉超紅”[24]、“蜜紅”[16]、“紅太陽”[23]、“晚紅寶”[25]為晚熟葡萄品種。許多多倍體表現(xiàn)出成熟期提前的特點，不同成熟期的葡萄品種極大的延長了葡萄的市場供應(yīng)，同一成熟期葡萄品種的豐富可滿足消費者多樣化的需求。

3.2.2植物學(xué)特性調(diào)查

調(diào)查嫩梢、新梢、幼葉、成齡葉、成熟枝條的各項植物學(xué)特征，為種質(zhì)的區(qū)別、鑒定提供依據(jù)。多倍體葡萄品種較二倍體葡萄多表現(xiàn)為莖粗、節(jié)間短、葉片大且厚，葉色濃綠，雌蕊柱頭高等特點[1]。

3.2.3生長結(jié)果習(xí)性

調(diào)查植株生長勢、萌芽率、副芽萌發(fā)力、隱芽萌發(fā)力、每結(jié)果枝果穗數(shù)、結(jié)果枝百分率、產(chǎn)量、坐果率等，對種質(zhì)生產(chǎn)力做評價。經(jīng)比較多倍體葡萄普遍較二倍體葡萄生長勢強、產(chǎn)量高，四倍體葡萄每穗花和果粒數(shù)較二倍體少。

3.2.4果實經(jīng)濟性狀

調(diào)查果穗的形狀、有無歧肩、有無副穗、大小、重量、緊密度，果粒的形狀、重量、大小，顏色、香味、脆度、營養(yǎng)含量、含種子數(shù)等。以對果實的品質(zhì)做評價。其中四倍體葡萄果粒大，三倍體葡萄果實無核或少核，且多倍體葡萄營養(yǎng)物質(zhì)含量較二倍體高。近年來育成的玫瑰香型葡萄品種有：“玉波一號”、“玉波二號”[20]、“早黑寶”[36]、“巨玫瑰”[17]、“晚紅寶”[25]、“秋黑寶”[35]、“黑玫香”[18]，草莓香型葡萄品種有：“月光無核”[10]、“申豐”[15]、“貴園”[30]、“峰后”[31]，具玫瑰香和草莓香的品種：“玫香寶”[11]以及具蜂蜜清香味的葡萄品種“蜜紅”[16]。以玫瑰香味為代表的香味葡萄深受消費者喜愛，選育香味葡萄是當(dāng)前育種的又一新趨勢。

3.2.5抗性

調(diào)查新品種的抗寒、抗旱、抗病蟲害性，為栽培管理提供借鑒。多倍體葡萄普遍體現(xiàn)出較強的抗性，“滬培3號”[6]、“滬培1號”[7]、“無核早紅”[8]、“紅標(biāo)無核”[9]、“春光”[19]、“禮泉超紅”[24]、“峰后”[31]等抗病性均較強，此外“玫香寶”[11]還具有較強的抗寒性，“月光無核”[10]抗旱性強。

4 存在的問題及展望

4.1 多倍體育種

目前，已培育出一大批四倍體優(yōu)良新品種，不僅生產(chǎn)上得到了大面積的推廣，同時又作為進一步培育新品種的育種材料。如秋黑葡萄單株芽變得到大粒、淡玫瑰香味的“紫地球”[61]與比坎、玫瑰香雜交育成具濃郁玫瑰香味的“達米娜”[62]雜交育成大粒，具濃郁玫瑰香味葡萄新品種“玉波一號”、“玉波二號”[20]。但葡萄三倍體育種育成品種少，二倍體與四倍體雜交胚挽救技術(shù)還有待進一步優(yōu)化[63]。在對雜交后代胚挽救時，不同雜交組合選擇培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基種類、激素種類及濃度等都需要進一步實踐與摸索[38]。葡萄胚挽救試驗中采用的胚發(fā)育培養(yǎng)時間長短不一，我們研究發(fā)現(xiàn)各雜交組合胚發(fā)育培養(yǎng)在65～95 d成苗效果較好。具香味、果肉脆甜、無核、大粒是消費者喜愛的葡萄性狀，可選擇無核果肉脆甜葡萄與大粒濃香型葡萄雜交，通過胚挽救技術(shù)，還可結(jié)合誘變育種技術(shù)，培育優(yōu)良性狀于一身葡萄多倍體新品種。此外，隨著基因工程的發(fā)展和葡萄抗病、無核基因的闡明，有望實現(xiàn)基因工程在葡萄育種中的應(yīng)用，高效培育目的性狀的葡萄新品種。

4.2 種質(zhì)評價

對種質(zhì)的全面評價是其栽培管理、市場前景評估的重要依據(jù)。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細胞技術(shù)可實現(xiàn)多倍體葡萄的早期、快速、大批量鑒定，從而提高育種效率[1]。許多育成葡萄新品種，由于未做倍性鑒定，不能確定其倍性，這大大局限了對葡萄新品種的開發(fā)利用。

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10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.026

2017-06-09

天津市科技計劃項目（16ZXZYNC00160），天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金（15010）。

溫曉敏（1991-）,女，山西晉中人，在讀碩士生，主要從事葡萄胚挽救育種研究。E-mail: 837760363@qq.com

*通訊作者：田淑芬（1966-），女，研究員，博士，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net