互花米草生物質及其侵染性海洋真菌特性研究

陳輝輝++金磊磊++喻靜++喻鎮東++姜曉龍++許偉++陳集雙++紹榮

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.142

摘要：測定了互花米草秸稈主要的化學組成：灰分8.73%，熱水抽提物10.97%，1% NaOH抽提物37.95%，苯-醇抽提物4.22%，克拉森木素24.62%，綜纖維素69.60%，戊聚糖23.75%；互花米草的纖維形態特征：平均纖維長度 1.06 mm，長寬比92.00，壁腔比0.37；研究結果預測互花米草若應用于化學制漿，用堿量較高，化學藥劑用量高，導致成本加大，灰分含量較高，黑液性能可能較差，黑液堿回收困難，將對環境造成污染。利用互花米草熱磨機械漿與化學漿板復配生產紙漿模塑產品為互花米草的利用開辟了一條新的道路。侵染互花米草的海洋真菌Buergenerula spartinae YDC07為兼性海洋真菌，最適生長的鹽濃度為2.5%；該海洋真菌侵染互花米草秸稈可以使其纖維素、半纖維素和木質素的含量降低?；セ撞萆镔|及侵染互花米草的海洋真菌特性的基礎性研究對實現互花米草的資源化利用具有重要的鋪墊作用。

關鍵詞：互花米草；化學成分；纖維形態；海洋真菌；最適鹽濃度；纖維分解

中圖分類號： S182；S184文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0494-05

收稿日期：2015-09-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：30971898）。

作者簡介：陳輝輝（1988—），男，江蘇南京人，碩士，主要從事植物真菌及真菌病毒的相關研究。E-mail：huihui_chen2012@163.com。

通信作者：邵榮，博士，教授，主要從事生物化工方面研究。E-mail：shaor1973@163.com?；セ撞荩⊿partina alterniflora）自1979年引入我國以來，在很多方面發揮著積極作用，如減緩風暴潮壓力、保護灘堤、促進圍墾、消除近海污染等[1]，但是由于互花米草的耐受力和繁殖能力等都比較強，也有許多消極的影響出現，如占據貝類棲息地、導致生物多樣性降低、導致沿海灘涂景觀改變、和當地物種形成競爭等方面[2]，因此已經逐漸成為影響我國沿海的最主要的入侵物種[3]。

制漿造紙過程中，植物纖維本身的化學組成和生物結構直接影響所得漿的品質[4]，通過對纖維形態、長寬度的測定、纖維細胞形態特點、化學成分分析等方面進行研究，為利用互花米草制漿提供理論根據。

從具有重要生態價值的鹽沼物種互花米草中分離的相關海洋真菌并沒有被徹底研究清楚，根據對Kohlmeyer 1979年[5]發表的相關資料的更新以及Kohlmeyer和Volkmann-Kohlmeyer 1991年[6]相關報道的補充和糾正，發現目前已經報道的來自互花米草的專性和兼性海洋真菌有39種[7-8]，但前人對互花米草中海洋真菌的長期研究告訴我們仍有很多未知海洋真菌有待于被發現。

真菌已經被證實在沿海沼澤地C、N的生化循環中扮演著非常重要的角色，例如美國東南部的沼澤地區真菌的產量達到了500 g/（m2·年）[9]，并且菌絲生物量相當于冬季沼澤地所有活體有機物的1/3[10]。真菌執行分解作用，它們可以有效地將植物有機物轉化為以真菌菌絲或生殖結構存在的真菌生物量[10]，更確切地說真菌建立了一個從真菌到細菌到動植物粉碎機的一個最具生產力的海洋生態循環系統[9-10]。美國東南部鹽沼地的互花米草分解系統是少有的真菌發揮作用的天然生態系統，直接通過顯微觀察，一些子囊菌物種已經被證實是互花米草植株的主要分解者[10-12]。同時，這些海洋真菌具有很強的分解木質纖維素和動植物尸體的能力[13-14]，具有潛在的應用價值。

本研究以江蘇沿海灘涂鹽堿地互花米草植株及前期研究得到的侵染互花米草的海洋真菌Buergenerula spartinae YDC07為材料，一方面對互花米草的化學組成和纖維形態進行了分析，另一方面對該真菌的最適鹽濃度及其侵染互花米草秸稈后互花米草纖維成分的變化進行了相關研究。

1材料與方法

1.1材料

試驗用互花米草秸稈于2012年10月9日采自江蘇省鹽城市大豐區大豐港沿海灘涂鹽堿地；侵染互花米草的海洋真菌Buergenerula spartinae YDC07于2014年3月經分離純化得到。

1.2試劑與儀器

微型高速植物粉碎機，普通光學顯微鏡，物鏡測微計，目鏡測微計，烘箱，玻璃濾器，電子天平，索氏抽提器等；碘化鉀，碘，氫氧化鈉，氯酸鉀，硝酸，苯，亞氯酸鈉，無水氯化鋅，磷酸氫二鈉，氯化銨，氯化鈣，三氯化鐵，硫酸鎂，硫酸亞鐵，氯化鈉，硫酸，丙酮，十二烷基硫酸鈉，四硼酸鈉，乙二醇乙醚，無水磷酸氫二鈉，α-淀粉酶，無水亞硫酸鈉，十六烷三甲基溴化胺，微型高速植物粉碎機，纖維分析儀，精密pH計，高濃節能磨漿機，數顯鼓風干燥箱，冰箱。

PDA配方：1 000 mL蒸餾水中加入200 g去皮馬鈴薯、18 g 葡萄糖（蔗糖），18 g瓊脂，121 ℃，滅菌20 min。

中性洗滌劑（g/L）：稱取18.61 g乙二胺四乙酸二鈉和6.81 g四硼酸鈉于1 000 mL燒杯中，溶解后再加入30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚，同時取4.65 g無水磷酸氫二鈉于另一燒杯中，加水溶解后傾于第一個燒杯中稀釋至 1 000 mL，此時溶液pH值為6.9～7.0[15]。酸性洗滌劑（g/L）：稱取20 g十六烷三甲基溴化胺于1 000 mL已標定過的0.50 mol/L硫酸溶液中，加熱攪拌使其溶解。0.50 mol/L硫酸溶液：取27 mL濃硫酸加入盛有500 mL水的燒杯中，冷卻后注入1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，標定。72%硫酸溶液：取734.69 mL濃硫酸，倒入200 mL水中，冷卻后稀釋至1 000 mL。

赫茲別格染色劑[16]：稱取20 g無水氯化鋅加入到10 mL的蒸餾水中配制成飽和溶液，作為A溶液；稱取2.1 g碘化鉀和0.1 g碘溶解在蒸餾水中，作為B溶液；冷卻后，在攪拌條件下將B加入到A溶液中，最后把混合液放置暗處24 h，倒出上清液，并加入少量碘；然后存入棕色試劑瓶中，在暗處存放48 h后備用[17]。

1.3互花米草的化學組成和纖維形態分析

1.3.1化學組成的測定原料水分含量根據GB/T 2677.2—1993標準測定；原料纖維素含量的測定采用硝酸-乙醇纖維素測定方法；原料酸溶木素含量根據GB/T 10337—1989標準測定；原料聚戊糖含量根據GB/T 2677.9—1994標準測定；原料灰分含量根據GB/T 2677.3—1993標準測定；苯醇抽提物根據GB/T 2677.6—1994標準測定；原料熱水抽提物根據GB/T 2677.4—1993標準測定；冷水和1% NaOH抽提物按ISO造紙工業國際標準（1993）測定。

1.3.2纖維形態分析纖維解離樣品的制備過程為：（1）將互花米草秸稈切成長度約1 cm，并且盡可能薄的細絲條狀，置于小燒杯中，沸水中煮沸0.5 h，使其軟化。（2）將上述燒杯中的液體棄去，加入濃度為35%的硝酸直到把原料蓋住，然后加適量的氯酸鉀，并在溫度為65 ℃左右的水浴鍋中溫浴，直到秸稈絲變為白色。（3）將上述秸稈絲洗滌后取少許放入小試管中，加入適量蒸餾水，然后劇烈搖動試管，使其解離成單根纖維。（4）最后用赫氏別格染色劑進行染色制片，顯微鏡觀察[16]。

切片樣品的制備過程為：互花米草秸稈經水中煮沸排氣、氫氟酸軟化、切片、番紅染色、不同濃度乙醇脫色、二甲苯透明，最后制片供觀察[16]。

1.4侵染互花米草的海洋真菌Buergenerula spartinae YDC07特性分析

1.4.1最適鹽濃度測定海洋微生物耐受鹽濃度的范圍為1.0%～7.0%，適宜生長的鹽濃度為2.0%～4.0%[18]。一般認為，從海洋環境中分離得到的微生物，生長必須在一定鹽濃度下，這類微生物被視為嚴格的海洋微生物[19]。若在不含鹽分的情況下都能生長，則是適應了非海洋環境的兼性海洋真菌[20]。

將該真菌分別接種到鹽濃度為0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%的PDA培養皿中，每組鹽濃度設3個平行，于28.0 ℃的恒溫培養箱中培養5 d，觀察菌落生長情況，判定該真菌的類型及其最適的鹽濃度。

1.4.2侵染后互花米草秸稈纖維測定侵染前后互花米草秸稈的纖維成分測定采用的是范氏洗滌纖維分析法，它可以準確地獲得生物質中所含的半纖維素、纖維素、木質素以及酸不溶灰分的含量，圖1為范氏洗滌纖維分析法原理，可以清晰地了解各部分操作的具體情況，也可以為生物質原料各組分含量的計算提供明確的步驟[21-22]。試驗稱取適量經烘干處理的互花米草秸稈接種到組培瓶中，經高溫高壓滅菌后于超凈工作臺中接種該海洋真菌菌塊，共3組分別為接種互花米草秸稈和真菌菌塊、只接種互花米草秸稈和只接種真菌菌塊，于28 ℃的恒溫培養箱中分別培養30 d后觀察其生長情況并測定其纖維成分。

2結果與分析

2.1化學組成測定結果

抽取物是植物原料中的少量成分之一，它包括脂肪族和芳香族的相關物質，其中包括堿水化合物、酸、萜烯類、酚類、樹脂酸、脂肪酸、乙醚油、樹脂和脂肪等。由表1可見，熱水抽提物含量與蘆葦接近；1% NaOH抽提物含量介于麥秸、蘆葦之間；苯-醇抽提物含量較高，比麥秸略低，較其他高。

灰分對普通紙張的質量及生產過程有一定影響。一般來說，灰分含量越高，堿回收難度越大，化學藥品消耗越大?；セ撞莸幕曳趾棵黠@高于其他原料（表2），這是因為互花米草生長在潮間帶，海水中含有較多的無機鹽類。

禾本科植物的半纖維素主要指戊聚糖，因此通過測定戊聚糖可以進一步明確禾本科植物中半纖維素含量。結果表明，互花米草綜纖維素含量較麥秸高，略低于皇竹草、楊木；戊聚糖含量較高，略低于麥秸，較楊木、蘆葦、皇竹草高（表2）。

植物原料中的主要化學成分之一就是木素，木素的化學結構在不同類型的原料中各不相同。一般來說，原料中的木素含量越少則制漿漂白越容易，并且所需要的化學品也越少。結果表明，互花米草克拉森木素含量較高，略低于蘆葦，高于麥秸、皇族草、楊木（表2）。

2.2纖維形態分析結果

原料的纖維形態和漿的性能具有極其重要的關系。本研究測得的互花米草及其他相關原料的纖維尺寸列于表3；互花米草及其他相關原料的纖維長度統計處理結果列于表4；

由表3可知，互花米草纖維的平均長度略短，大于楊木，其纖維寬度較大，大于蘆葦、皇竹草等材料，但比楊木窄。其纖維長寬比較小，可預測其制漿較為細膩，其相應的撕裂度、裂斷長、耐折度等指標均適中。由表4可知，互花米草纖維長度分布比率變化趨勢與蘆葦、麥秸和皇竹草大致相同。纖維細胞厚度和直徑的比值（纖維壁腔比）直接影響紙張的柔性程度，比值小則說明纖維柔性較好，制漿時纖維之間的接觸面積較大，因此其結合力較強，獲得的紙張強度也較高，影響最為顯著的是成紙的耐破度。Runkel[23]在深入研究的基礎上提出：很好的原料一般壁腔比都小于1；壁腔比=1為好原料；劣質原料的壁腔比則大于1。不過壁腔比值也并不是越小越好，太小纖維本身的強度就會太差，雖然柔性很好，但是成紙的強度并不是很高。

2.3最適鹽濃度測定結果

侵染互花米草的真菌在鹽濃度為0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的PDA培養皿中5 d后生長情況如圖2所示，可以看到該真菌在0%～4.0%的鹽濃度范圍內都可以生長，并且在鹽濃度2.0%時菌落的生長情況最好，說明此真菌為兼性海洋真菌，并且2.0%鹽濃度可能為其最適生長鹽濃度。

2.4侵染后互花米草秸稈纖維成分測定結果

該海洋真菌對互花米草的侵染如圖3所示，可以看出該海洋真菌確實可以在互花米草秸稈上進行生長。經范氏洗滌纖維法測定，互花米草秸稈被真菌侵染前后的纖維成分測定結果如表6所示，可以看出侵染前后互花米草秸稈的纖維素、半纖維素和木質素成分都有減少，說明該海洋真菌侵染互花米草秸稈并使其干物質量減少的原因主要是分解其纖維素、半纖維素和木質素成分。

3討論與結論

從互花米草的化學組成方面看：互花米草灰分、熱水抽提物、1% NaOH抽提物、苯-醇抽提物、克拉森木素、綜纖維素、戊聚糖含量分別為8.73%、10.97%、37.95%、4.22%、24.62%、69.60%、23.75%?；セ撞莸幕曳趾枯^高，這是因為互花米草長期生長在灘涂，體內的無機鹽含量較高；互花米草克拉森木素含量較高，略低于蘆葦，高于麥秸、皇族草、楊木。從表1、表2可以預測互花米草應用于化學制漿時，用堿量較高；灰分含量較高，黑液性能可能較差，黑液堿回收時比較困難；互花米草若應用于大規模化學制漿，化學藥劑用量高，會增加生產成本，而且黑液堿回收困難，將對環境造成污染。雖然互花米草也可以用于化學制漿，但從環境保護和經濟效益的方面來考慮，不適合大規模工廠化生產。若利用互花米草熱磨機械漿與化學漿復配生產紙漿模塑產品，一方面可解決灘涂互花米草有效利用的問題，變廢為寶，另一方面利用廢報紙、廢棄的黃紙板，實現了纖維的二次利用，保護環境。互花米草漿與廢棄的報紙漿、黃紙板漿等生產出的紙漿模塑產品是一種環境友好型產品，廢棄后短時間內可以實現降解，從技術層面上開辟了有效的廢棄纖維生物質資源利用模式。

從互花米草纖維細胞形態方面看：互花米草平均纖維長度1.06 mm，長寬比92.00，壁腔比0.36。其纖維的平均長度相對較短，和楊木比較接近，其纖維寬度相對較大，比蘆葦、皇竹草等材料都大，但和楊木相比較窄。其纖維長寬比較小，比楊木大，比蘆葦、皇竹草等小，推測其纖維交織度較好；其纖維壁薄，比蘆葦、皇竹草小，壁腔比比麥秸大，與楊木相當，可預測互花米草纖維硬挺度較大，成紙時其纖維之間的接觸面積較小，并且其纖維之間的結合力也較小，成紙后其強度可能較低。

對互花米草秸稈的化學組成和纖維形態分析表明：互花米草是一種可利用的造紙纖維原料，而對于大規模的工廠化生產，從成本和保護環境的角度來考慮，互花米草熱磨機械漿復配化學漿生產紙漿模塑產品，為互花米草的有效利用開辟了一條新道路。

侵染互花米草的海洋真菌Buergenerula spartinae YDC07為兼性海洋真菌，最適生長的鹽濃度為2.5%，并且其可以使互花米草纖維素、半纖維素和木質素的含量降低，針對此特性，不但可以對該海洋真菌的培養條件進行優化，而且可以利用該海洋真菌對互花米草等秸稈進行降解，以便后續工業產品的開發，這樣既提高了效率又節省了成本。

目前我們前期的研究已經在江蘇大豐港沿海灘涂鹽堿地的入侵植物互花米草中發現攜帶線粒體病毒的海洋真菌，并向NCBI提交該真菌rRNA的ITS序列（GenBank登錄號：KJ459363）以及該真菌攜帶的線粒體病毒的序列（GenBank登錄號：KJ485703）。本研究對互花米草生物質及其侵染性海洋真菌特性進行了研究，為后續將二者結合起來投入到資源化和產業化利用中提供基礎。

參考文獻：

[1]Wang G，Qin P，Wan S，et al. Ecological control and integral utilization of Spartina alterniflora[J]. Ecological Engineering Econ，2008，32（3）：249～255.

[2]Simenstad C A，Thom R M. Spartina alterniflora （smooth cordgrass）as an invasive halophyte in Pacific Northwest estuaries[J]. Hortus Northwest，1995，6（12）：38-40.

[3]李富榮，陳俊勤，陳沐榮，等. 互花米草防治研究進展[J]. 生態環境，2007，16（6）：1795-1800.

[4]王菊華，薛崇昀. 造紙原料纖維分析及其在造紙工業的應用[J]. 造紙信息，2006（2）：1-4.

[5]Kohlmeyer J，Volkmann-Kohlmeyer B. Fungi on Juncus and Spartina：new marine species of Anthostomella，with a list of marine fungi known on Spartina[J]. Mycologia，2002，106（3）：365-374.

[6]Gessner R V. Seasonal occurrence and distribution of fungi associated with Spartina alterniflora from a Rhode Island Estuary[J]. Mycologia，1977，69（3）：477-491.

[7]Pena N I，Arambarri A M. Hongos marinos lignicolas de la laguna costera de Mar Chiquita（Provincia de Buenos Aires，Argentina）. Ⅰ. Ascomycotinay Deuteromycotina sobre Spartina densiflora[J]. Darwiniana，1998，35：61-67.

[8]Pena N I，Arambarri A M. Hongos marinos lignicolas de la Provincia de Buenos Aires（Argentina）. Ⅳ[J]. Darwiniana，1998，35：69-74.

[9]Miller J D，Whitney N J. Fungi of the Bay of Fundy. Ⅴ：Fungi from living species of Spartina Schreber[J]. Proceedings of the Nova Scotian Institute of Science，1983，33：75-83.

[10]Newell S Y. Multiyear patterns of fungal biomass dynamics and productivity within naturally decaying smooth cordgrass shoots[J]. Limnol Oceanogr，2001，46（3）：573-583.

[11]Newell S Y，Porter D. Microbial secondary production from saltmarsh-grass shoots，and its known and potential fates[J]. Kluwer Academic，2000，72：159-185.

[12]Newell S Y. Spore-expulsion rates and extents of blade occupation by ascomycetes of the smooth-cordgrass standing-decay system[J]. Bot Mar，2001，44（3）：277-285.

[13]Bergbauer M，Newell S Y. Contribution to lignocellulose degradation and DOC formation from a salt marsh macrophyte by the ascomycete Phaeosphaeria spartinicola[J]. FEMS Microbiol Ecol，1992，86（4）：341-348.

[14]Newell S Y，Porter D，Lingle W L. Lignocellulolysis byascomycetes（Fungi）of a saltmarsh grass（smooth cordgrass）[J]. Microscopy Res Techn，1996，33（1）：32-46.

[15]趙學篤. 農業原料學[M]. 北京：機械工業出版社，1986：61.

[16]劉書釵. 制漿造紙分析和檢測[M]. 北京：中國輕工業出版社，2003.

[17]王菊華. 中國造紙原料纖維特性及顯微圖譜[M]. 北京：中國輕工業出版社，1998.

[18]張志華，康應田. 海洋真菌分類鑒定方法探析[J]. 安徽農業科學，2009，37（21）：9825-9826.

[19]Okami Y.Marine microorganisms as a source of bioactive agents[J]. Microb Ecol，1986，12：65-78.

[20]林鵬. 中國紅樹林生態系[M]. 北京：科學出版社，1997：23-30.

[21]王曉艷. 生物油及相關生物質原料的特性分析[D]. 長春：吉林農業大學，2005.

[22]楊勝. 飼料分析及飼料質量檢測技術[M]. 北京：北京農業大學出版社，1993.

[23]楊淑蕙. 植物纖維化學[M]. 北京：中國輕工業出版社，2001.