大豆響應高溫脅迫的生理和分子遺傳機理研究現狀與展望

李佳佳，鄭雙雨，孫根樓，張文明，王曉波，邱麗娟

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大豆響應高溫脅迫的生理和分子遺傳機理研究現狀與展望

李佳佳1，鄭雙雨1，孫根樓1，張文明1，王曉波1，邱麗娟2

（1安徽農業大學農學院，合肥230036，2中國農業科學院作物科學研究所/農業部作物基因資源與遺傳改良重大科學工程/農業部作物基因資源與 種質創制重點實驗室，北京100081）

大豆是重要的經濟作物，是植物油脂和蛋白質的重要來源。近年來，因全球氣候變化引起的高溫脅迫頻發，危及到大豆生長的各個時期，成為制約大豆產量和品質的重要因素之一。為了揭示大豆耐高溫性的遺傳機理，建立綜合高效大豆耐高溫評價體系，促進大豆耐高溫特性的遺傳改良，現對大豆響應高溫脅迫的生理生化基礎和分子調控機制進行綜述。相較于適溫條件，高溫脅迫可使大豆植株發生葉片增厚、氣孔導度下降、細胞膜透性增加、細胞微觀組織結構受損以及滲透調節物質（脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白）含量變化和抗氧化防御系統關鍵酶活性喪失等生理異常反應，導致植株光合、蒸騰和呼吸作用及物質含量等一系列生理生化過程紊亂。高溫脅迫還造成大豆花粉形態異常，絨氈層細胞結構松散、空泡化和自溶化，花粉活力及其萌發率明顯下降，花粉敗育率增高，致使大豆結莢率和結實率顯著降低，進而影響大豆籽粒的正常發育、蛋白的積累和產量形成等，最終導致減產；高溫脅迫對大豆籽粒外觀品質性狀也能造成一定損傷，進而對其經濟價值帶來不利影響。高溫脅迫從轉錄、翻譯和代謝水平影響大豆正常的生理代謝調控。目前，已通過高通量測序等方法鑒定出多個與大豆高溫脅迫響應相關的轉錄因子、蛋白及代謝產物，但與水稻、擬南芥的研究相比仍存在較大差距；初步建立了以花粉活力和多項生理指標為基礎的大豆耐高溫鑒定方法，但在生產上尚缺乏系統高效耐高溫評價體系，耐高溫大豆育種工作進展緩慢。國內在大豆耐高溫預防措施、耐高溫綜合評鑒體系建立、優異耐高溫大豆種質資源篩選及耐高溫關鍵功能基因挖掘等方面仍然存在挑戰。為應對極端生態環境給大豆生產造成的不利影響，未來應通過建立綜合高效大豆耐高溫評價技術體系，提高大豆優異種質資源鑒定水平，重點解析大豆耐高溫的分子遺傳機理、挖掘耐高溫關鍵基因，結合常規育種和分子育種技術培育綜合性狀優異的耐高溫大豆新品種，以實現大豆品種耐高溫性與高產、優質的統一。

大豆；高溫脅迫；耐熱性；生理生化特性；分子機理

0 引言

溫度是控制植物生長和發育的關鍵因素[1]。全球氣候變化情況表明，2100年全球平均氣溫預計將會比1980—2000年的平均氣溫增加1.8—4.0℃或更高[2]，其中，夜溫的增幅將遠大于日溫的增幅[3]。高溫（high temperature，HT）將是未來氣候的重要特點之一[4]。HT脅迫能夠顯著影響植物的正常生長發育，造成細胞膜完整性損傷，葉片或花器官組織畸變，花粉活力及萌發率下降、花粉敗育，結莢率降低、種子組分構成異常及數量下降，最終導致作物產量和品質均顯著下降[4-15]。由HT環境引起植物的生理性傷害稱為HT傷害（脅迫），HT脅迫已經對全球作物的生產構成了嚴重威脅[16-17]。

大豆是重要的經濟作物，富含油分和蛋白質，能夠為人類和動物提供重要的食用油和高蛋白飼料資源[18-19]。大豆最適生長溫度在發芽和成熟期為15—22℃、開花期為20—25℃，當環境溫度高于28°C時能夠影響大豆正常的發育進程[12,20]。相較于營養生長階段，生殖生長時期（R1—R7）對HT脅迫更加敏感，當環境溫度達到33—40℃時將嚴重減緩大豆植株的生長進程并造成發育異常[21]。溫度變化已經在很大程度上影響了大豆的分布、生長、產量和品質等[19-20]。HT脅迫能夠增加大豆葉片厚度、降低氣孔開度、增加細胞膜透性、擾亂細胞微觀組織結構，進而導致花粉形態和絨氈層細胞異常[4,14,22]。HT對大豆植株的光合作用和蒸騰作用能夠產生直接的強烈脅迫危害[16]，造成大豆植株光合速率顯著下降[4,12]、蒸騰作用明顯加劇[17,23-25]以及呼吸速率異常[15,26]等，植株體內物質含量和抗氧化保護酶系統也發生顯著性變化[14-15,22-23,27]。HT脅迫還能顯著降低大豆植株花粉活力及其萌發率，增加花粉敗育率，進一步影響大豆籽粒發育和產量形成，最終可能造成減產，甚至絕收[12,14-15,18]。研究發現，在18/12℃和26/20℃（晝/夜）之間大豆種子產量會隨著溫度的增加而增加，當溫度高于26/20℃時其產量將會下降[28-29]。進一步研究表明，溫度每增加1℃就會導致大豆產量下降16%—17%[30-31]。HT脅迫不僅對大豆的生理生化產生危害，還能通過轉錄、翻譯和代謝水平對大豆的正常生長發育產生廣泛影響[26,32-39]。

高溫對大豆的生長發育造成了顯著的不利影響，個別年份對中國黃淮海流域大豆安全生產構成了一定威脅，但目前中國在大豆耐HT生理生化基礎和分子遺傳機理方面的研究進展仍十分薄弱。因此，研究大豆耐HT生理生化機制、明確耐高溫防御策略、完善大豆耐HT綜合評鑒體系、篩選耐HT大豆新種質及培育耐高溫大豆新品種將是未來基礎研究和育種家的工作重點和共同努力方向。同時，隨著高通量基因鑒定方法、基因編輯技術和大豆轉基因技術的成熟，為大豆耐HT候選基因/蛋白功能的驗證、耐HT分子生物學基礎和分子遺傳機理的解析創造了條件。鑒于此，本文就近年來國內外對HT脅迫在大豆生理生化上的影響和耐HT性分子遺傳機理探索等方面的研究進展進行梳理和總結，提出了當前形勢下大豆耐HT生產發展面臨的挑戰和機遇，旨在為實現大豆耐HT生產與高產、優質的統一提供理論基礎和技術支撐。

1 高溫脅迫對大豆主要生理生化代謝的影響

1.1 高溫脅迫影響大豆細胞組織結構和膜穩定性

細胞膜是防止胞外物質自由進入細胞的屏障，既能維持細胞內穩定的代謝環境，又能調節和選擇物質進出細胞[40]。HT脅迫下，細胞原生質膜的結構和功能會首先受到傷害，造成膜透性增加、細胞內電解質外滲，導致組織浸出液的相對電導率增大[23,41-42]。葉片是植物感受HT脅迫最直接的組織器官，HT脅迫下，大豆葉片中細胞質膜、葉綠體膜和類囊體膜的完整性均出現不同程度的損傷，其中，類囊體膜對HT脅迫更為敏感[4]。此外，HT脅迫還導致大豆葉片細胞中的線粒體膜、線粒體嵴、基質及線粒體邊緣均被完全扭曲，同時，細胞的線粒體和葉綠體的大小及數量均表現出縮減的趨勢[4]。HT脅迫能夠顯著增加大豆葉片中柵欄組織、海綿層和下表皮的厚度，導致植株葉片增厚，同時，還能明顯降低葉片的氣孔開度[4]。HT高濕脅迫處理后，大豆種皮細胞明顯變疏松、種皮內空隙增多，柱狀細胞、海綿組織和種皮橫切面厚度均顯著增厚，尤其是海綿組織增厚程度最明顯[22]。HT脅迫下的大豆花粉粒細胞外壁變得較厚，絨氈層出現空泡化且具有自溶性，生殖細胞呈梭形、染色質呈凝聚狀態等[14]，花粉粒的解剖結構表現出明顯的異常形態。HT脅迫加劇了植物細胞膜脂過氧化損傷可能是造成質膜透性增大和電解質滲漏的重要原因。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是細胞膜脂過氧化作用的產物之一，它的產生能夠加劇細胞膜的損傷[43]。MDA含量越高，表明植物的膜脂過氧化作用越強，植物細胞膜受到的損傷就越嚴重。韓永華等[23]研究發現HT/滲透脅迫會導致大豆葉片中的MDA水平顯著升高，對細胞膜形成傷害。不同參試大豆材料的MDA含量受HT影響增幅不同，增加幅度在15%—64%[27]。HT脅迫下，大豆幼苗葉片中MDA的積累會隨溫度升高和脅迫時間的延長而迅速增加，結果表明，大豆的膜脂過氧化程度與HT脅迫關系密切[24]。此外，MDA含量的增長不僅取決于絕對溫度，還與脅迫時間的長短相關[44]。MDA水平在一定程度上反映了細胞膜脂的過氧化損傷程度，可作為評價大豆HT脅迫損傷的生理指標。

1.2 高溫脅迫對大豆光合、蒸騰和呼吸作用的影響

光合作用是植株產量形成的基礎，也是植物對HT脅迫最敏感的生理過程之一[16]。沈證言等[45]研究發現，HT脅迫后，菜豆葉片的光合作用普遍受到抑制，受抑程度因品種的耐熱性而異。隨著溫度升高和脅迫時間的延長，大豆葉片中葉綠素含量逐漸下降，且溫度越高下降越快；脅迫時間越長，葉綠素含量越低，葉綠素合成速率下降、葉綠體結構與功能受損，進而導致光合作用異常[24]。在對大豆耐熱材料K03-2897的研究發現，HT脅迫同時顯著降低了葉片的葉綠素含量、光系統Ⅱ量子效率（FPSⅡ）以及光合速率[4]，導致大豆植株光合速率和氣孔導度分別下降了20.2%和12.8%[4,13,15]。在HT和干旱雙重脅迫條件下，大豆植株氣孔導度降幅最大可達93%，凈光合速率均呈下降趨勢[27]。此外，相較于適溫條件（28/18℃），HT脅迫（38/28℃）使大豆葉片的光化學效率和光合速率分別顯著下降了5.8%和12.7%[12]。有意思的是，HT脅迫下植株在很短的時間內其光合作用就會受到抑制，但隨著HT時間的延長，植株會逐漸適應HT下的生存環境，其光合速率也會隨之提高[46]。因此，在HT脅迫下，能夠維持較高光合同化能力的大豆品種可初步判定其具有耐熱潛力。

植物的蒸騰作用會隨著溫度的增加而增強，可以起到降溫的作用，防止葉片被HT灼傷[47]。HT脅迫下，葉片蒸騰強度的變化主要體現在植株體內的含水量上，因此，相對含水量是植物蒸騰作用的直觀表現[24]。HT脅迫下，大豆葉片相對含水量明顯降低，隨著溫度升高和脅迫時間的延長，蒸騰作用加劇，大豆體內水分的虧缺越來越嚴重[23-24]。溫度每增加3℃或以上將導致大豆植株蒸騰速率上升和冠層導度下降，并進一步影響籽粒大小造成大豆產量下降[25]。因此，HT能夠直接導致大豆植株蒸騰作用異常從而進一步影響其生長發育[17]。

一般情況下，溫度升高往往會使植物出現呼吸速率加快，但當溫度升高到一定范圍時，呼吸速率反而下降，這在其他物種上已得到證實[48-50]。DJANAGUIRAMAN等[15]研究發現，HT脅迫處理10 d后，大豆葉片呼吸速率明顯增強，同時需要消耗相應同化物（碳水化合物）才能維持植物正常的呼吸作用需求。HT脅迫能夠使植株呼吸作用產生過激行為，這對大豆植株同化物的積累是極為不利的[26]。HT對于植株呼吸作用的影響比較復雜，涉及到一系列的酶促反應和物質代謝等，其響應HT脅迫的變化規律仍需進一步探索。

1.3 高溫脅迫影響大豆滲透調節物質代謝和保護酶系統的平衡

植物在逆境脅迫下，會形成脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白質等一些滲透調節物質，從而保持植物細胞水勢的平衡[51]。研究表明，脯氨酸可以抑制細胞膜透性的增大和MDA含量的增加[47]，同時，脯氨酸含量的大幅增加也有利于植物組織對水分的保持，從而減緩由HT脅迫引起的蒸騰作用加劇對植株產生的傷害[46]。隨著環境溫度的升高和脅迫時間的延長，大豆植株葉片相對含水量下降，質膜透性增大，就會降低脯氨酸合成酶類對脯氨酸反饋抑制的敏感性，進而導致大豆體內游離脯氨酸含量急劇增加[24]。過表達的大豆植株在HT脅迫期間的脯氨酸含量也呈現出增長趨勢，最高增幅可達50.0%，結果表明，滲透調節物質含量的增加可以在一定程度上增強過表達轉基因株系的耐熱性[27]。

可溶性糖對植物細胞具有滲透調節及保護細胞膜結構穩定的作用[52]。對生理成熟期的大豆品種進行HT高濕脅迫處理，發現隨脅迫時間的延長大豆種子中可溶性糖含量呈上升趨勢[22]。HT脅迫還能使大豆葉片中可溶性糖水平隨溫度的升高而呈現明顯的增加趨勢，增幅為61.5%—91.0%[27]。此外，在HT脅迫下，大豆葉片中的還原糖和總可溶性碳水化合物含量增加，而蔗糖含量下降，蔗糖含量的下降可能是由于光合作用減弱導致植株體內碳水化合物合成下降所致[13]。由此可知，大豆體內可溶性糖含量的積累可能是其提高抗熱性的一種潛在機能，以減緩HT對植株不同組織部位的傷害程度。研究表明，可溶性蛋白具有滲透調節和防止細胞脫水的功能[53]。HT脅迫雖然能夠使大豆葉片中可溶性蛋白含量增加[13]，但其與HT脅迫的具體關系尚未明了，仍需進一步探索。

植物體內抗氧化酶促防御系統包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等，它們的主要功能是清除植物體內產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧陰離子自由基，減輕膜脂過氧化程度，因而成為植物抗熱性生理基礎研究之一[54]。HT/滲透脅迫下，吉林27號和白農6號2個品種的SOD酶活性均升高，一定程度的脅迫處理可能激活了SOD酶活性，嚴重（或持續性）的脅迫將會抑制其活性。在脅迫處理下，白農6號中的CAT酶活性升高，變化趨勢與SOD酶活性相似；而吉林27號中CAT酶活性則呈現下降趨勢，因此，作者推測白農6號大豆品種抗HT的能力大于吉林27號[23]。DJANAGUIRAMAN等[12]研究發現，HT脅迫導致大豆葉片中SOD、CAT和POD等酶活性分別下降13.3%、42.9%和44.6%，造成這些抗氧化酶活性喪失的主要原因可能是由于HT脅迫下ROS的大量產生所致。進一步分析發現，HT脅迫下葉片中超氧陰離子自由基、過氧化氫含量以及細胞膜損傷程度在HT脅迫下分別提升了63.0%、70.4%和54.7%，這個結果驗證了上述的推測。隨后的研究再次表明，HT脅迫導致大豆葉片中ROS增加，抗氧化酶活性降低，造成氧化性損傷，最終可能會造成葉片過早衰老[13]。此外，大豆幼苗葉片中SOD活性在HT脅迫初期呈明顯增加趨勢，說明在HT脅迫初期，大豆幼苗可以通過增加SOD活性來提高其耐熱性；但隨著脅迫時間的延長，SOD活性呈現出下降趨勢，大豆幼苗受害明顯加重[24]。

綜上所述，SOD、POD、CAT和APX等植物抗氧化酶促防御系統中的酶活性對植物的生長發育至關重要。HT脅迫導致這些酶活性喪失或下降，將會造成植物體內ROS或自由基水平上升，對植物組織細胞造成傷害，甚至死亡。

1.4 高溫脅迫影響大豆花粉活力、產量和品質形成

花粉活力及萌發率的高低直接關乎到豆科作物最終的有效結實率和籽粒產量。植物生長發育期間，當水分不是限制因子外，溫度對于花粉粒、花粉管生長和座果率等生殖過程的影響較之其他因素均比較明顯[19]。在花粉發育、萌發和花粉管生長期間，環境脅迫的加劇（尤其是HT）將會影響花粉的功能和最終的結實率[19]。無論是單一的HT脅迫或HT與CO2及UV-B輻射的組合脅迫均能造成大豆植株基序花瓣和雄蕊柱長度變短、花朵變小，進而導致花粉粒發育異常、花粉管長度縮短且花粉萌發率降低[55]。HT脅迫不僅造成大豆植株花粉發育異常、氣孔和柱頭發育明顯減緩等[18]，還導致大豆花粉細胞畸變、外壁增厚且絨氈層解體，進而使大豆體外花粉萌發率顯著下降了22.7%[14]。進一步研究發現，高日溫或夜溫脅迫均能造成大豆花粉活力、花粉萌發及結莢率顯著下降，并最終導致籽粒產量下降[15]。此外，花粉粒中飽和磷脂與磷脂酸類物質水平在HT脅迫下的減弱也可能是花粉萌發率降低的一個原因。另外，大豆花粉的萌發率降低或敗育或許還與HT脅迫導致絨氈層的過早衰退有關[56]。綜上所述，HT脅迫導致花粉萌發及其活力的喪失可能是豆類作物籽粒產量下降的主要原因[57-59]。鑒于此，可以將花粉活力及其萌發率的高低作為一個重要生理指標應用到大豆品種資源的篩選和耐熱型評價體系中。

HT脅迫影響大豆生理生化的最終結果會體現到其產量上。THOMAS等[60]研究發現一個受生長素調控的基因（）在HT脅迫下顯著下調表達，說明HT脅迫可能導致大豆種子發育進程發生了變化。另外，一個在大豆種子正常發育期間表達的β-葡萄糖苷酶基因，在28/18℃生長條件下的大豆種子中能夠檢測到，但在40/30℃生長條件下的大豆種子中未檢測到，說明大豆種子組分發育的正常進程可能被HT脅迫打亂。HT脅迫下，大豆種子萌發率和活力均顯著下降，種子畸變的比率明顯提升[61]。從出苗到開花期，溫度增高可使大豆植株的百粒重增加，但從出苗期到鼓粒期，持續的HT脅迫能夠導致大豆單株產量顯著下降[62]。在開花和結莢期間，HT脅迫能夠造成大豆植株種子形成率下降，并減緩種子的生長；從開花期到成熟期，每天白天35℃HT脅迫處理10 h，可造成最大減產量約為27.0%；但高夜溫處理后，在任何生殖生長階段均未發現有明顯的產量丟失，因此，大豆產量的下降可能主要歸咎于白天的HT脅迫所致[29]。DJANAGUIRAMAN等[12,14]研究表明，在HT脅迫下，大豆結莢率、結實率、種子大小和每株種子產量分別下降了35.2%、18.6%、64.5%和71.4%，推測其原因可能是由于HT脅迫造成大豆花粉解剖結構變化導致花粉萌發率下降所致。該團隊隨后的報道再次表明了相似的結果[15]。相較于低溫脅迫（22/18℃），大豆的生物量和籽粒產量在HT脅迫（36/32℃）下的降幅比例要大很多[63]。此外，HT脅迫時間的長短與大豆種子組分異常也有一定關系，長時間的HT脅迫能夠造成大豆種子產量組分產生更大的負向效應，種子產量組分會隨著溫度的升高而呈線性下降[17]。

HT脅迫下大豆品質性狀的變化可能會直接影響到大豆的經濟價值。大豆種子在HT（33℃）脅迫下展現出油分含量下降、蛋白質濃度增加的結果表明，HT脅迫對種子填充和成熟期階段的油分、蛋白質和脂肪酸組分的影響較大[64]。隨著溫度的升高，大豆含油量和油分碘值普遍下降，而蛋白質含量則普遍增加，這對大豆種子中蛋白質的積累可能是有利的[65]。多數人的觀點是，當溫度升高到31℃時，種子總油分含量就開始下降[66-68]，也有人認為，大豆種子總油分含量在32℃[60]或33℃[69]時達到最大值，之后隨溫度的升高而下降。而大豆種子蛋白含量在HT脅迫下則表現出上升趨勢[66,69]，特別是種子發育晚期，溫度對蛋白質含量的影響極為顯著[66]。因此，宋曉昆等[70]認為蛋白含量高、脂肪含量低的品種較耐HT，高蛋白材料可以作為耐HT型大豆篩選的潛在對象。

2 大豆響應高溫脅迫的分子遺傳機理

2.1 大豆耐高溫相關基因的挖掘和解析

解析耐HT相關基因功能及其參與的代謝調控網絡，對闡明作物耐HT分子遺傳機制，推動耐HT遺傳育種和生產發展具有重要意義。當前，很多作物耐熱基因已經被鑒定，其中大多數是數量性狀位點（quantitative trait loci，QTL），例如水稻中的和[71]，、和等[72]。此外，轉錄因子基因在植物的HT脅迫信號轉導以及耐HT響應過程中也能發揮重要作用[32,73-78]，其中大多數屬于熱激轉錄因子（Hsf（heat stress transcription factor）和Hsp（heat shock protein））基因。

轉錄因子DREB2A不僅能夠調控植物響應干旱和鹽害等脅迫，還能在HT脅迫下誘導擬南芥植物體中HsfA3的表達從而提高其耐熱性[73-74]。將水稻中一個A2型Hsf基因過表達導入擬南芥，結果發現，轉基因擬南芥中一些脅迫相關基因（尤其是Hsp類）能夠被誘導高度表達，同時，在其營養生長、花莖伸長和種子發育階段均表現出較強的抗HT性[75]。此外，諸如[76]、（與DREB2A互作）[77]和[78]等轉錄因子基因在植物耐HT脅迫響應中也能發揮重要功能。模式植物中這些耐HT性相關基因的挖掘和功能解析，不僅為闡明作物耐HT分子遺傳機理提供了重要的理論基礎，同時，也為大豆耐HT關鍵基因的挖掘和功能分析指明了方向。過表達轉化大豆，不僅能夠激活轉基因大豆植株體內熱激蛋白基因的轉錄，還增強了另外2個基因和的表達，顯著提高了轉基因大豆植株的耐HT能力（52℃）[27,32]。LI等[33]利用在線工具鑒定并分析了38個大豆Hsfs家族基因的遺傳結構和蛋白功能域，并驗證的過表達改善了擬南芥植物對干旱和HT脅迫的忍耐性。大豆HSP70基因家族的全基因組表達譜分析結果表明，HSP70家族基因不僅參與大豆組織器官的發育，還對HT和干旱脅迫產生應激響應，從而保護大豆植株抵抗非生物脅迫的危害[34]。此外，大豆中受赤霉素誘導的MYB類轉錄因子結合蛋白1（）基因過表達轉化煙草的結果發現，相對于WT材料（葉片失綠變黃、萎蔫壞死），48℃下HT脅迫的轉基因煙草葉片并未明顯變黃；55℃HT脅迫后，轉基因煙草幼苗存活率為24.14%，仍高于WT。結果表明，過表達大豆能在一定程度上提高轉基因煙草幼苗的耐HT性[35]。

2.2 大豆耐高溫性分子遺傳機理

近年來，高通量測序技術、基因工程等新興分子生物學技術的發展與成熟，為探索作物耐逆性分子機理提供了有利工具，并為耐逆性相關基因的挖掘提供了便利條件。研究發現，HT脅迫在轉錄、翻譯和代謝等多個方面對作物的生長發育產生了廣泛影響，目前已鑒定出多個作物響應HT脅迫的相關基因、蛋白質、代謝物和相關代謝通路。擬南芥耐HT性的增強可能與熱激蛋白誘導表達、激素調控（如脫落酸（abscisic acid，ABA）和水楊酸（salicylic acid，SA））、ROS以及UVH6等代謝途徑有關[79]。而參與糖酵解和三羧酸循環、氨基酸代謝、淀粉和蔗糖代謝等碳水化合物合成途徑的蛋白（如甘油醛3-磷酸脫氫酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉和酶等）以及許多氧化還原平衡蛋白（如抗壞血酸氧化酶和過氧化物酶等）表達豐度的變化可能對水稻谷粒乳熟期、蠟熟期和成熟期耐HT性的提升具有重要作用[80]。隨著分子生物學技術的發展，有關大豆耐HT性分子遺傳機制的研究也被相繼報道。VALDéS-LóPEZ等[36]對HT脅迫下的大豆根毛進行了轉錄組和蛋白質組比較分析，共鑒定出10個關鍵基因調控模塊能夠響應HT脅迫，另外還發現多種蛋白的表達豐度在HT脅迫下發生變化，結果表明，HT脅迫處理6h后，大豆根毛中的大部分差異基因/蛋白都能直接參與到HT脅迫響應中。利用傳統2D-DIGE（two-dimensional differential gel electrophoresis）技術對HT、干旱以及HT與干旱互作脅迫下的2個大豆品種葉片進行蛋白質組比較分析，結果發現，44個非生物脅迫響應蛋白表現出差異性，表明多種信號串聯和分子過程可能受到了HT和干旱脅迫的影響。進一步分析發現，EF-Tu蛋白和HSPs相關蛋白在HT脅迫下的上調或高豐度表達可能是大豆耐HT機制增強的主要原因之一[37]。此外，相較于適溫（28/24℃）和低溫（22/18℃）處理，在HT（36/32℃）脅迫下共檢測到35個大豆種子組分代謝物表現出差異性，其中天冬酰胺、組氨酸、纈氨酸、莽草酸和油酸等代謝物水平在HT脅迫下顯著升高，結果表明HT脅迫已經對大豆種子組分及其代謝物水平產生了嚴重影響[38]。而耐熱型和熱敏感型大豆種子代謝組表達譜分析結果進一步發現，多種抗氧化代謝物，包括生育酚、黃酮類、苯丙素類和抗壞血酸前體等在耐HT基因型大豆種子中高度富集，也可能是大豆種子耐HT性的主要原因之一[39]。上述研究已經從不同方面或以不同技術對大豆不同組織部位響應HT脅迫的相關分子機制進行了探索分析，但鑒于作物對HT脅迫的響應機制比較復雜，不同的品種、組織部位和發育時期等對HT脅迫的響應機制也不盡相同，因此，為了全面了解大豆耐熱性遺傳機理，仍需對大豆耐熱性相關分子機制做深入的探索研究。

3 展望

3.1 完善高溫脅迫下大豆田間綜合防控措施

研究發現，在大豆遭受HT脅迫期間，葉面噴施乙烯感知抑制劑——1-甲基環丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）能夠顯著提高大豆植株的結實率和種子大小，并進一步提高其最終產量[12]。其原理是1-MCP可以通過增強植株體內的抗氧化防御系統降低乙烯產出率并延遲葉片的過早衰老，從而保證了植株的正常發育。進一步研究證實，葉面噴施1-MCP對大豆抵抗HT脅迫具有較好的防御效果[13]。外源噴施2,4-表油菜素內酯（2,4-epi-brassinosteroid，EBR）通過改善大豆植株光合作用也能提高其耐HT性，同時，還能緩解由HT脅迫造成的大豆品質劣變和低產等[81]。此外，SA、ABA和6-BA等分別在葡萄[82]、水稻[83]和番茄[84]上的葉面噴施以及外源性抗氧化防御和解毒物質谷胱甘肽在綠豆上的施用[85]等均已表明，植物生長調節劑或抗氧化防御物質能夠提高作物對HT脅迫的抵抗作用，這對大豆抗HT生產或許是一條有效的防御措施。

農作物在長期的進化和馴化過程中能夠形成一種適應新環境的獨特優點。因此，適當時間和強度的HT處理鍛煉，能夠激發植物體內的防御系統并產生適應HT環境下的生長機制。顧和平等[86]研究發現，通過連續十年的HT季節種植大豆，其耐熱性（37/30℃）有了明顯改善，產量也顯著提高，這種改善是一種逐步且緩慢的過程。其原因可能是大豆在開花結莢期遇HT天氣導致植株體內部分耐熱基因被激活，這種激活是不可逆的，一旦被激活將會在后代中穩定遺傳，并逐步增強大豆的耐HT能力。這種通過HT鍛煉來增強作物耐HT的能力在豌豆[87]和玉米[88]等作物上也已經得到了證實和應用。因此，抗HT鍛煉對大豆來說也可能是一種提高其耐HT性的潛在方法。此外，在大豆的生產栽培過程中, 還可以采用平衡施肥、合理密植、及時灌溉等田間管理配套措施，調節田間小氣候，實施健身栽培，提高大豆的抗HT性。同時，在探索并掌握大豆耐HT性遺傳規律的基礎上，也可以因地制宜，采取有效措施，避免或降低HT脅迫對大豆生產帶來的影響。

3.2 建立高效大豆耐高溫綜合評鑒體系

正如前文所述，花粉活力對于大豆的有效結實及其最終產量形成至關重要，相關研究指出花粉活力可以作為鑒定大豆耐HT脅迫的一個重要生理指標加以考察[15,18]。以花粉活力綜合響應指標（花朵和花粉形態、花粉產量、萌發率和花粉管長度等在不同脅迫（CO2、HT和UV-B輻射）下的變異性）作為各基因型總的脅迫響應指標（total stress response index，TSRI），將6種基因型大豆劃分為脅迫忍耐型（DG5630RR和D88-5320）、中間型（D90-9216和PI 471938）和敏感型（Stalwart III和DP4933RR）[55]，其中耐HT型大豆對HT脅迫不敏感，而中間型和敏感型大豆均表現出花粉變形、花粉萌發率下降、氣孔及柱頭減少等現象。基于此，SALEM等[18]對44種基因型大豆進行耐HT性分型，通過計算不同基因型品種的最大花粉萌發率、花粉管長度以及最高溫度、最適溫度和最低溫度分別對不同基因型品種花粉萌發率和花粉管長度的溫度效應值，然后將這8個獨立脅迫響應指標的總和作為每種基因型大豆總的溫度累積響應指標（cumulative temperature response index，CTRI，無量綱）。根據CTRI值，將13種基因型大豆品種歸為耐HT型、22種劃為HT中間型、9種為HT敏感型。綜上所述，以花粉活力等綜合響應指標的鑒別體系對篩選和評鑒耐HT性大豆品種或許是一條有效的方法。

此外，以營養和生理參數等綜合響應指標為基礎的評價體系對篩選和評鑒耐HT型大豆品種也可能是一種重要途徑。KOTI等[89]以營養和生理參數響應脅迫指標為標準對上述6種基因型大豆耐脅迫性再次評鑒分型。基于該綜合指標，6種基因型大豆被分為脅迫忍耐型（PI471938和D88-5320）、中間型（D90-9216和DG5630RR）以及敏感型（StalwartⅢ和DP4933RR），與利用花粉活力作為評價標準得出的結果存在一定差異[55]。靳路真等[90]通過主成分分析將13個大豆的一級生理指標（百粒重、單株粒重等）轉化為6個綜合性指標，獲得耐熱性綜合評價值，然后基于該綜合值將國內外155份大豆種質劃分成6種類型，即強耐熱型Ⅰ、耐熱型Ⅱ、中度耐熱型Ⅲ、中度敏感型Ⅳ、敏感型Ⅴ和極敏感型Ⅵ；并根據綜合值鑒定出4個耐熱型品種和63個熱敏感型品種。最終篩選出7個開花期耐熱性鑒定指標（百粒重、單株莢重、每莢粒數、莖粗、主莖節數、節間長度和蛋白質含量）和7個鼓粒期耐熱性鑒定指標（單株粒重、單株莢重、每莢粒數、單株莢數、地上部干物重、株高和節間長度），2個時期的耐熱性鑒定指標包含了產量性狀和形態性狀，但并不完全一致。

盡管有些作物在抗HT鑒定上已經得到成功應用，但仍缺乏普遍性，目前尚無統一的標準評鑒體系。當前，在大豆耐HT評鑒過程中，哪個發育期最具代表性、是以自然環境下的HT還是在此基礎上浮動1—5℃進行脅迫處理等均未達成統一認識，這使得大豆耐HT研究的范圍更加寬泛，也為大豆耐HT研究提出了一定挑戰。此外，僅用單一的產量、形態或品質等生理生化指標不能完全準確評判大豆的耐HT性等級，需補充相應的參數指標和當地氣候變化規律等。小麥[91]和茄子[92]等作物的耐HT性田間或溫室直接鑒定法結合其生理指標等間接鑒定法或許可以為大豆品種耐HT性鑒定提供一定的經驗。另外，以花粉活力及其萌發率為基礎，結合其他生理生化指標形成一種響應HT脅迫的綜合性指標對耐HT型大豆品種的鑒定可能也是一種有效方法。因此，探索和建立一種綜合性、科學化和系統性的大豆耐HT性等級標準及篩選和評鑒體系方法是非常必要的，對大豆育種和生產發展也具有一定的理論意義。

3.3 發掘和培育耐高溫大豆新種質

從根本上解決大豆抗HT生產，還需要在挖掘和培育耐HT型大豆新品種方面下功夫。常規的大豆耐HT育種方法有雜交育種、誘變育種和突變體育種等。相比之下，轉基因育種可能也是一條有效途徑。陳曉軍等[32]的研究已經表明，過表達轉基因大豆株系能夠顯著提高轉基因大豆材料的耐熱性（52℃），同時，轉大豆材料的獲得也將有助于大豆耐熱性分子機制的研究。此外，相較于早熟品種，晚熟品種大豆全生育期階段的植株葉面積、豆莢和粒數及產量水平在HT脅迫下是增加的，結果表明，晚熟品種在HT脅迫下可以通過改良產量源（葉面積和葉片光合作用）和增加庫容量（花朵、豆莢及籽粒的數量）來保持或提高其產量[93]。該結果為選育耐熱型大豆品種（晚熟）提供了育種方向。

轉基因育種對大豆耐熱型新品種培育是一條有效途徑，且隨著大豆轉基因技術體系的日益成熟，未來有望在這個方面取得突破性進展。目前國內的大豆轉基因體系和轉基因作物推廣等方面仍然存在諸多問題，給轉基因耐高溫大豆新品種培育帶來一定挑戰。中國大豆種質資源豐富，尤其是野生大豆在抗逆性和適應性方面要優于栽培大豆，因此，挖掘野生大豆中的優異耐熱基因資源用于豐富大豆的遺傳基礎，對提升大豆抗HT脅迫能力以及培育耐HT大豆新品種具有重要意義。

4 展望

HT脅迫已經嚴重威脅到了作物的分布、生長、產量和品質，甚至生存。大豆是重要的經濟作物，對HT脅迫比較敏感，在中國高蛋白大豆主產區的黃淮海流域，HT脅迫目前已演變成一種主要的非生物逆境，對當地大豆生產安全構成了極大威脅。因此，全面了解HT脅迫對大豆生理損傷的遺傳機理，建立高效大豆耐HT綜合評價體系，發掘大豆耐HT型種質資源，利用新興分子生物學技術全面解析大豆耐HT性分子遺傳機制、鑒定相關候選基因和代謝產物，闡明大豆耐HT分子代謝調控機理，實現大豆品種耐HT性與高產優質的統一，將成為豐富未來大豆育中基礎理論和應用研究的重要方向。

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（責任編輯 李莉）

Advances and Perspectives in Research of Physiological and Molecular Mechanism of Soybean Response to High Temperature Stress

LI JiaJia1, ZHENG ShuangYu1, SUN GenLou1, ZHANG WenMing1, WANG XiaoBo1, QIU LiJuan2

(1College of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI)/Key Laboratory of Crop Gene Resource and Germplasm Enhancement (MOA), Beijing 100081)

Soybean is a key economic crop, and is an important source of plant protein and oil. In recent years, high temperature (HT) stress caused by global climate change has threatened the key growth period of soybean, and has become one of the main environmental factors which limited the yield and quality of soybean. In order to reveal the molecular mechanism, establish a comprehensive efficiency evaluation system and promoting genetic improvement of soybean resistance to HT stress, the physiological and biochemical basis and molecular regulation mechanism responding to HT stress of soybean were reviewed in this paper. Compared to optimum temperature, the thickness of leaves increased, the stomatal conductance decreased, the membrane permeability increased,cell microstructure and its integrity damaged, the osmoregulation substances (proline, soluble sugar and protein) changed and the key enzyme activities of the antioxidant defense system in soybean have been lost under HT stress, these results will lead to disorders of a series of physiological processes in soybean, which include the photosynthesis, transpiration, respiration and substance content, etc. Besides, HT stress also caused the abnormalities of pollen morphology, the tapetum cytoplasm is not dense, showing vacuolated and autolysis, the pollen vigour and germination rate are significantly decreased, and pollen abortion rate increased, thus resulting in the pod-set rate and seed-set percentage remarkable decrease, and affecting the normal development and protein accumulation of seed and yield formation of soybean, and ultimately leading to lower yields of soybean. Meanwhile, HT stress can also cause some damage to quality traits of seed, and then has an adverse effect on its economic value of soybean. Moreover, normal physiological metabolism is widely affected by HT stress at the level of transcription, translation and metabolism. At present, many transcription factors, proteins and metabolites response to HT stress in soybean have been identified by the method of high-throughput sequencing, however, there is still a wide gap compared with research on rice and. Currently, the comprehensive stress response indexes based on pollen viability andseveral physiological parameters have been used to screen HT resistance soybean varieties, but, the method of system identification is still imperfect in soybean production, and thus leading to the slow progress in selection of HT resistant soybean. Up to date, challenges are still existed in preventive measures, the establishment of a comprehensive evaluation system, screening for excellent soybean germplasm related to resistance to HT, and identification of key functional genes resistance to HT stress in soybean. The adverse effects of extreme ecological environment on soybean production will be further aggravated with the uncertainty of global climate change. In the future, the main focuses should be put on the establishment of a comprehensive evaluation technology system, improvement of the identification level of soybean germplasm resources, elucidation of molecular genetic mechanism and excavation ofkey genes resistance to HT in soybean. Selecting new soybean varieties with resistance to HT stress by both of the conventional breeding and molecular breeding technologies, thus will provide a theoretical basis and technical support for achieving the unification of HT resistance as well as high yield and quality in soybean.

soybean; high temperature stress; heat tolerance; physiological and biochemical characteristics; molecular mechanism

2016-12-26；接受日期：2017-04-12

國家重點研發計劃（2016YFD0100201）、安徽省教育廳自然科學重點項目（KJ2016A843）、安徽省引進高校領軍人才團隊項目

李佳佳，E-mail：lijia6862@163.com。通信作者王曉波，E-mail：wxbphd@163.com。通信作者邱麗娟，E-mail：qiulijuan@caas.cn