血必凈對爆炸致家兔急性肺損傷的保護作用及其機制研究*

黃鑫，郝建，李樹雯，馬宏昊，李魯歡，賀慧博，李成恩

（1.安徽醫科大學解放軍杭州臨床學院，浙江杭州310007；2.浙江省杭州一二八醫院心肺康復科，浙江杭州310007；3.中國科學技術大學近代力學系，安徽合肥230027）

論著

血必凈對爆炸致家兔急性肺損傷的保護作用及其機制研究*

黃鑫1，郝建2，李樹雯2，馬宏昊3，李魯歡2，賀慧博1，李成恩1

（1.安徽醫科大學解放軍杭州臨床學院，浙江杭州310007；2.浙江省杭州一二八醫院心肺康復科，浙江杭州310007；3.中國科學技術大學近代力學系，安徽合肥230027）

目的探討血必凈對爆炸致家兔急性肺損傷（ALI）時肺組織核轉錄因子-κB（NF-κB）活性的影響及其對ALI的作用機制。方法將32只清潔家兔隨機分為4組，每組8只。對照組（NS）、ALI組、低劑量血必凈干預組（L-XBJ）和高劑量血必凈干預組（H-XBJ）。爆炸致傷家兔，復制ALI動物模型后，L-XBJ、H-XBJ組分別注射10和20 ml/kg血必凈溶液，NS、ALI兩組注射等量生理鹽水。24 h時采集靜脈血及部分肺組織，測定肺濕干重比（W/D），酶聯免疫吸附法檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素10（IL-10）水平，Western blot檢測肺組織NF-κB蛋白表達量，逆轉錄聚合酶鏈反應檢測肺組織NF-κB mRNA表達水平，光鏡下觀察肺組織病理學改變。結果L-XBJ、H-XBJ組W/D小于ALI組并呈濃度依賴性。與ALI組比較，血必凈可以降低血清中TNF-α、IL-6含量，降低NF-κB mRNA和蛋白表達，提高IL-10含量。肺病理切片顯示，ALI組肺組織嚴重出血、水腫及大量炎癥細胞浸潤，L-XBJ、H-XBJ組肺損傷程度明顯減輕。結論血必凈干預能顯著下調促炎因子TNF-α、IL-6水平及上調抗炎因子IL-10水平，并抑制NF-κB活化，阻斷其介導的炎癥反應通路，減輕ALI，保護肺組織。

血必凈；急性肺損傷；爆炸傷；核轉錄因子-κB

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭，肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞的損傷而導致的肺部炎癥和肺通透性增加是其常見的病理特征。爆炸傷是ALI的常見致病因素之一，無論是戰爭引起的爆炸傷，還是和平環境中火災、金屬粉塵等爆炸傷均可導致肺微血管和肺泡上皮的大范圍損傷，各種炎癥細胞、炎癥介質、肺泡內蛋白的滲出增多，肺間質及肺泡水腫，進而導致嚴重的通氣血流比例失調、進行性呼吸窘迫，甚至造成器官組織嚴重損毀而死亡[1]。作為常見危重病，ALI死亡率高達40％[2]，且缺乏有效的治療經驗和方法，嚴重威脅重癥患者的生命安全。研究證實，炎癥反應的失控、促炎因子與抗炎因子的失衡是ALI發病的重要機制，其中核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）作為調控、轉錄核內眾多炎癥因子的開關[3]，在介導ALI的發生、發展中起著重要作用[4]。盛潔瑩[5]和劉佳等[6]針對嚴重創傷患者的研究表明，血必凈在ALI治療中能夠有效地拮抗內毒素，抑制腫瘤壞死因子的失控性釋放，清除體內炎癥介質，使急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發生率明顯下降，療效顯著。本研究主要通過復制爆炸致家兔ALI模型，觀察ALI NF-κB在血必凈干預后的活性變化情況，然后對其下游細胞因子水平的變化規律、血必凈用于應急救治的臨床價值進行分析，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

血必凈注射液（天津紅日藥業股份有限公司），酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorben assays，ELISA）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司），NF-κB、Western blot試劑盒（美國Sigma公司，批號：148G3026），NF-κB逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司，批號：00145205），一種新型總RNA抽提試劑（Trizol）設備（美國Invitrogen公司，批號：14105），引物合成設備（美國Invitrogen公司），山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：109525），山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：109145），熒光定量聚合酶鏈反應儀（美國Thermo公司，PIKOREAL96）。

1.2 動物分組和ALI模型復制

普通級家兔32只，雌雄各半，重量（2.25±0.25）kg，購于安徽長臨河醫藥科技有限公司，合格證號：SCXK（皖）2006-002，自由喂養。將家兔按隨機數字表法分為對照組（NS）、ALI組、低劑量血必凈干預組（L-XBJ）和高劑量血必凈干預組（H-XBJ），每組8只。實驗前所有家兔禁食12 h、禁水4 h，雙耳部備皮，耳中塞入脫脂棉球，胸部脫毛以避免兔毛對爆炸沖擊波強度產生影響。家兔固定于自制鋼質保護箱中，胸部前方箱體處開一窗口，窗口大小與家兔胸部范圍一致。頭頸部、腹部及四肢等其余部位均保護在箱體內，將保護箱置于空中爆炸容器內并固定。爆炸源采用工業炸藥，并將其制成重為35 g的球形藥包，爆心距為35 cm，采用標準8號雷管進行引爆，同時保持藥包中心、家兔胸部中心和空中壓力傳感器位于同一水平線。傳感器置于距藥包35cm處，記錄測點處壓力時程曲線，爆炸實施過程由專業人員操作和控制[7]。爆炸后，爆炸容器內立即排風換氣，迅速取出實驗家兔至通風環境下，并實施簡單的急救措施，立即檢查并縫合胸壁破口，清理呼吸道以保持呼吸道通暢，胸腔穿刺排氣減壓，靜脈注射平衡鹽溶液以改善循環，側臥位觀察家兔的精神狀態、應激反應等，并記錄家兔體溫、呼吸、心率、死亡率等情況。模型復制成功后，對實驗家兔進行藥物干預。治療藥物血必凈的劑量參照曹文偉[8]在膿毒癥的研究中使用的劑量改良而成。L-XBJ、H-XBJ組分別注射10和20 ml/kg血必凈溶液，NS、ALI兩組注射等量生理鹽水。爆炸后存活＜1 h的樣本，定為現場死亡。本研究中實驗家兔處置方法經安徽醫科大學動物倫理學審查通過。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 肺濕干重比（W/D）測定分離右肺中葉，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱濕重（wet weight,W）,濕肺置入80℃烤箱內72 h完全脫水后，再稱干重（dry weight，D）。以肺W/D表示肺組織含水量，計算公式為：W/D=濕肺重/干肺重。

1.3.2 血清TNF-α、IL-6、IL-10的測定采集24h靜脈血，室溫下3 000 r/min勻速離心10 min，收集上清液置于-80℃冰箱冷凍保存。用ELISA檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行[9]。

1.3.3 肺組織NF-κB蛋白表達檢測按照試劑盒說明書，剪取右肺組織，稱重，加入從動物組織和動物細胞中抽取的可溶性蛋白細胞裂解液1 ml進行裂解，室溫下12 000 r/min勻速離心10 min，收集上清液，即含有組織總蛋白。經電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟后，得到蛋白電泳條帶。

1.3.4 肺組織NF-κB mRNA表達檢測按照試劑盒說明書，采用Trizol法抽提肺組織總RNA，逆轉錄成cDNA并進行熒光定量PCR反應。反應條件如下：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40個循環。選取GAPDH作為內參基因，根據擴增曲線確定Ct值，采用2-△△ct法計算目的基因表達相對值。NF-κB P65引物序列如下，正向引物：5'-TGGTCAGCTCCCTTCTCTGT-3'，反向引物：5'-TACCTCCAGCCTGCTTCTGT-3'。

1.3.5 肺組織病理學觀察取右下肺中部組織置于10％中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One way ANOVA），組間兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺W/D，血清TNF-α、IL-6及IL-10比較

爆炸后24 h，各組家兔肺組織W/D，血清TNF-α、IL-6及IL-10比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P=0.000）。W/D及TNF-α、IL-6經SNK-q檢驗，ALI組較NS組升高（q=18.286、60.213和25.419，P=0.000），L-XBJ組較ALI組降低（q=8.819、44.763和14.169，P=0.000），H-XBJ組較ALI組降低（q=13.492、53.597和20.631，P=0.000），以H-XBJ組降低最明顯（q=4.673、8.834和6.461，P=0.000）。IL-10經SNK-q檢驗，ALI組較NS組升高（q=6.125，P=0.000），L-XBJ、H-XBJ組均較ALI組升高（q= 3.851和19.860，P=0.000），以H-XBJ組升高最明顯（q=16.009，P=0.000）。見表1。

2.2 各組家兔肺組織NF-κB蛋白表達比較

肺組織中NF-κB蛋白表達量ALI組最明顯，且隨血必凈劑量增加，L-XBJ、H-XBJ組的蛋白表達水平逐漸降低。見圖1、2。

2.3 各組家兔肺組織NF-κB mRNA表達比較

表1 各組家兔肺W/D，血清TNF-α、IL-6及IL-10含量比較（n=8，x±s）

圖1 Western blot檢測各組NF-κB蛋白表達水平

各組家兔肺組織NF-κB mRNA表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。經SNK-q檢驗，ALI組較NS組升高（q=25.756，P= 0.000），L-XBJ、H-XBJ組較ALI組降低（q=11.009和 17.799，P=0.000），且以H-XBJ組降低最明顯（q= 6.790，P=0.000）。見表2和圖3。

圖2 Western blot檢測各組NF-κB蛋白表達水平（n=8，x±s）

表2 各組NF-κB mRNA表達水平比較（n=8，x±s）

圖3 NF-κB mRNA的表達

2.4 各組家兔肺組織病理學改變

光鏡下觀察：NS組肺組織結構清晰可見，肺泡壁完整，肺泡腔內無出血、水腫液，無炎癥細胞浸潤，間質無滲出。ALI組肺微血管及肺泡隔毛細血管擴張充血，肺泡壁破裂，肺泡腔和肺泡隔內大量紅細胞和液體滲出，可見炎癥細胞浸潤，肺間質水腫，偶有透明膜形成，肺泡大小不一，可見肺不張及代償性肺氣腫，肺泡間隔明顯增厚。L-XBJ、H-XBJ組肺毛細血管擴張充血，肺泡腔出血、滲出，炎癥細胞浸潤較ALI組明顯減輕，以H-XBJ組最為明顯，肺間質水腫明顯吸收。見圖4。

圖4 各組家兔肺組織病理學變化（HE×400）

3 討論

實驗前，各組家兔均呼吸平穩，正常飲食、飲水。爆炸致傷后，ALI組家兔呼吸急促，心率加快，口唇、耳部等皮膚黏膜相繼呈發紺表現，部分家兔口鼻腔黏膜充血伴泡沫狀分泌物，煩躁不安，雙肺部干、濕啰音明顯，少數家兔出現短暫昏迷，提示爆炸致家兔呼吸功能不全。L-XBJ、H-XBJ組亦存在上述癥狀，且損傷程度較ALI組減輕，以H-XBJ組最明顯。家兔肺組織肉眼觀：NS組家兔肺表面呈均勻粉紅色，均質，包膜光滑、完整，無破損病灶，切面無液體溢出。ALI組肺表面呈暗紅色，體積顯著增大，可見廣泛出血灶，切面富含蛋白質的粉紅色泡沫狀液體溢出。L-XBJ、H-XBJ組肺表面呈暗紅色，切面充血水腫輕，肺體積較ALI組減小。爆炸后，肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞受損，大量炎癥細胞激活、增殖，釋放大量蛋白酶、細胞因子等，誘發全身失控性炎癥反應，同時導致血管通透性增加，組織液生成和回流失衡，肺水腫及透明膜形成，以及誘發代償性肺氣腫、肺不張等病變，使肺順應性下降，進而引起肺通氣血流比例失調，呼吸困難。本實驗中，各組家兔爆炸后呼吸加快、心悸、口唇紫紺、煩躁不安，隨后出現肺部啰音、口鼻分泌物、昏迷等癥狀，伴有呼吸困難、窘迫，肺病理學改變符合ALI病理變化標準[10]，提示爆炸致家兔ALI的造模成功。

相關研究表明，炎癥介質的激活、釋放，炎癥反應的失控是ALI疾病發病的本質[11]。而NF-κB作為調控、轉錄核內眾多炎癥因子的開關，當機體遭受各種致病因素后，活化的NF-κB促發一系列炎癥細胞因子的基因表達，并可誘發全身炎癥反應綜合征，因此炎癥反應的早期干預已成為治療ALI，保護肺組織的關鍵。靜息狀態下，NF-κB多以p50/p65二聚體的形式與其抑制蛋白IκB相結合,以無活性狀態存在于胞漿中。當細胞受到脂多糖、TNF-α等信號刺激后，IκB磷酸化后，逐漸與NF-κB分離，NF-κB被激活，活化的NF-κB迅速移位入細胞核與靶基因的特異序列結合，從而啟動信號通路和基因轉錄，誘導相關基因表達。NF-κB通過促發TNF-α、IL-6及繼發性炎癥因子的轉錄，啟動肺部炎癥；反之，TNF-α進一步激活NF-κB，形成正反饋，增加炎癥持續應答時間，放大炎癥反應。TNF-α由活化的單核/巨噬細胞分泌產生，可誘導中性粒細胞向炎癥部位聚集，并釋放大量趨化因子，同時激活內皮細胞釋放IL-6、IL-8等炎癥因子，使炎癥反應進一步失控，引起肺組織損傷。IL-6促進巨噬細胞分化，直接損傷血管內皮細胞，QI等[12]認為，IL-6含量增高與肺炎癥反應呈正相關。另外，ALI過程中還啟動抗炎反應，NF-κB活化后，IκB的含量被上調，核內NF-κB的活性逐漸下降。IL-10是其中最重要的抗炎因子之一，直接抑制炎癥免疫應答，同時顯著抑制單核巨噬細胞、中性粒細胞表達IL-6、TNF-α等。IL-10可抑制多種炎癥細胞活化，維持促炎因子和抗炎因子的平衡狀態，減輕肺損傷[13]。本實驗顯示，ALI組模型復制成功后，W/D，血清NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-10水平均明顯提高，表明NF-κB參與炎癥反應過程，通過調控TNF-α等細胞因子的轉錄，在ALI的發生、發展中起著重要作用，與文獻報道一致。

血必凈是由紅花、赤芍、當歸、丹參等組成的中藥復方制劑，WANG[14]和高潔等[15]研究表明，血必凈治療ALI是通過對各種炎癥介質的免疫調理作用，調節促炎因子與抗炎因子的平衡，并通過抑制中性粒細胞在肺組織中的滲出和炎癥介質的過度表達，從而保護肺組織。肺濕干重比是反應肺組織水腫程度的指標。本實驗中，血必凈干預組的濕干重比小于ALI組，且高、低劑量組比較，差異有統計學意義，表明高劑量血必凈可以減輕爆炸致ALI的病變嚴重程度，降低血管通透性，減少蛋白和液體的滲出。另外，從數值上看，血必凈干預組肺部炎癥反應較ALI組明顯減輕，表明血必凈在ALI早期就能有效下調促炎因子TNF-α、IL-6水平及抑制NF-κB活化，并上調抗炎因子IL-10水平，促進炎癥的吸收，修復肺損傷。不同劑量的血必凈均能抑制炎癥因子的活性,以高劑量的血必凈干預效果最為明顯。

綜上所述，血必凈通過抑制NF-κB的活性，阻斷其介導的炎癥反應通路，減少炎癥細胞的遷移與聚集，進而減輕肺部炎癥反應及肺水腫，有效阻滯ALI病理進程，保護肺組織。

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（童穎丹 編輯）

Protective effect of Xuebijing on blast-induced acute lung injury in rabbits and its mechanism*

Xin Huang1,Jian Hao2,Shu-wen Li2,Hong-hao Ma3,Lu-huan Li2,Hui-bo He1,Cheng-en Li1
(1.Hangzhou Clinical College of Chinese People's Liberation Army,Anhui Medical University, Hangzhou,Zhejiang 310007,China;2.Department of Cardiopulmonary Rehabilitation, Hangzhou 128 Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310007,China;3.Department of Modern Mechanics,University of Science and Technology of China,Hefei,Anhui 230027,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Xuebijing on activity of nuclear transcription factor-kB in the lung tissues of rabbits with blast-induced acute lung injury(ALI),and its mechanism.MethodsA total of 32 rabbits were randomly divided into 4 groups:normal control group(NS),ALI group,Xuebijing intervention groups of different doses(L-XBJ and H-XBJ groups).Each group had 8 rabbits.After the establishment of blast-induced ALI model of rabbits,the rabbits in the L-XBJ and H-XBJ groups were intravenously injected with different doses of Xuebijing(10 and 20 ml/kg respectively),while the rabbits in the NS group and the ALI group were injected with normal saline of the same volume.Part of the lung tissues and venous blood were collected at the 24th hour.The wet to dry weight ratio(W/D)was determined.The serum levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukins(IL-6 and IL-10)were measured by enzyme-linked im－munosorbent assay(ELISA).The expression of NF-κB protein in the lung tissues was evaluated by Western blot.The expression level of NF-κB mRNA in the lung tissues was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The pathological changes of the lung tissues were observed under light microscope.ResultsThe dry to weight ratio in the L-XBJ and H-XBJ groups was lower than that of the ALI group in a concentration-dependent manner.Compared to the ALI group,Xuebijing in the treatment groups greatly inhibited the serum levels of TNF-α and IL-6 and decreased the expression of NF-kB mRNA and protein,but increased the content of IL-10.Pathological examination of the pulmonary tissues indicated severe hemorrhage,edema and abundance of inflammatory cell infiltration in the ALI group;the degree of lung damage was obviously reduced in the L-XBJ and H-XBJ groups.ConclusionsThe interference of Xuebijing could significantly down-regulate the levels of proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6,up-regulate antiinflammatory cytokine IL-10,inhibit the activation of NF-κB;thus block the inflammatory response pathway, alleviate acute lung injury and protect lung tissues.

Xuebijing;acute lung injury;blast injury;nuclear factor-kB

R563

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.006

1005-8982（2017）01-0029-06

2016-02-29

南京軍區醫藥衛生科研基金（No：14ZD41）

郝建，E-mail：jianhao105@163.com