熒光定量聚合酶鏈反應技術在結核病診斷中的應用價值探討

陸飛越+建華+仁其+婷婷+良平

結核病是由結核分枝桿菌（MTB）感染引起的慢性傳染病，對疑似結核病人進行痰抗酸桿菌涂片染色鏡檢及分枝桿菌培養，直接找到病原菌，對診斷結核病具有重要意義。但上述兩種方法也有其局限性：涂片鏡檢法總的敏感性為22%～80%[1]，并且無法在鏡下區分與MTB形態、染色相同的非結核分枝桿菌（NTM），而NTM 與MTB一樣嚴重威脅人類健康[2-3]。分枝桿菌培養法是臨床診斷結核病的“金標準”，但該方法靈敏度也不夠高，陽性率約為40%～60%[4]，并且該法檢測周期長，從培養至菌種鑒定一般需要8周甚至更長，且對早期結核菌感染者、藥物治療后細胞壁缺損L型細菌難以檢出。為此，找到一種適合基層醫療單位應用，并能快速、靈敏診斷結核病，有效區分MTB與NTM的實驗室診斷方法，在臨床上有重要應用價值。熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）是一種在聚合酶鏈反應（PCR）體系中引入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR擴增進程的方法，可對標本中起始DNA模板進行定量，提高檢測靈敏度，同時省去了電泳步驟，減少污染機會，特異性更好。FQ-PCR結果以循環閾值（Ct值）表示， Ct值越小，說明起始模板核酸濃度越高。本研究試圖應用FQ-PCR法檢測痰標本中MTB，以為臨床提供一種快速、靈敏、特異的結核病輔助診斷方法。

1 材料與方法

1.1標本來源

分批收集自2013年5月—2014年6月，在平湖市第一人民醫院（結核病定點診斷醫院）留取的經抗酸桿菌涂片染色鏡檢陽性，且同時開展了分枝桿菌培養的合格痰標本共計115份，凍存于-20℃冰箱供FQ-PCR法檢測MTB使用。

1.2儀器與試劑

儀器有安捷倫公司的MX3000P實時熒光定量PCR儀、貝克曼庫爾特高速冷凍離心機、生物安全柜、-80℃超低溫冰箱等。試劑為中山大學達安基因股份有限公司的結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法），針對結核分枝桿菌特異性插入序列6110（IS6110）進行檢測，所有試劑均在有效期內使用。

1.3方法

用4% 氫氧化鈉對樣本進行前處理，提取核酸，上機進行PCR擴增及熒光檢測，之后分析檢測結果。擴增條件：93℃持續2 min預變性，93℃ 45s→55℃ 60s循環10次，之后93℃ 30s→55℃ 45s循環30次，設置55℃用FAM通道檢測熒光信號。

1.4結果判斷

陰性對照品無S型擴增曲線，陽性對照品擴增呈S型曲線，樣本Ct值=30或無數值判為陰性，樣本擴增呈S型曲線，且Ct值<30判為陽性。

1.5統計學分析

將不同方法檢測結果錄入Excel數據庫，運用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。

2 結果

本次收集的115份痰涂陽標本中，用FQ-PCR法檢測，檢出MTB陽性106份，陽性率為92.2%；用改良羅氏培養法培養，經PNB/TCH試驗鑒定為MTB的87份，陽性率為75.7%，用SPSS 16.0軟件進行卡方檢驗，兩者差異有非常顯著的統計學意義（χ2=11.63，P<0.001），見表1。

115份痰涂陽標本中，FQ-PCR法檢測MTB結果有9份陰性，占7.8%（9/115）。115份痰涂陽標本中，用改良羅氏培養法培養，結果分枝桿菌陽性97份，陽性率為84.35%，其中經PNB/TCH試驗鑒定為NTM的10份，占培養陽性數的10.3%（10/97）， 占涂陽數的8.7%（10/115）；培養結果分枝桿菌陰性16份，報告污染雜菌的2份。用改良羅氏培養法培養，經PNB/TCH試驗鑒定為NTM的10份標本中，FQ-PCR法檢測MTB結果陰性4份，陽性6份；FQ-PCR法檢測MTB結果陰性的9份標本中，除4份培養鑒定為NTM外，3份培養結果陰性，2份培養結果MTB陽性。

3 討論

本研究結果表明，用FQ-PCR法檢測115份痰涂陽標本，檢出MTB陽性106份，陽性率為92.2%；而用改良羅氏培養法鑒定，結果MTB陽性87份，陽性率為75.7%，兩者差異有非常顯著的統計學意義。表明FQ-PCR法檢測MTB是一種快速、靈敏的檢測方法，對于臨床早期診斷結核病具有重要的應用價值。按照0.05 mL痰涂片成200 mm2的標本膜，用100×油鏡觀察，每片約有5 000個視野，而鏡檢結果為1+的報告標準為3～9條/100視野，按此計算，鏡檢結果1+的痰含菌量至少在3 000條/mL。另一方面，FQ-PCR法的檢測靈敏度為10個菌即可檢出（達安基因提供）。在此基礎上，結合分析痰涂片結果及FQ-PCR檢測結果，對痰涂片結果抗酸桿菌陽性，特別是菌量在1+以上的，而FQ-PCR法檢測MTB陰性的情況，極有可能為NTM感染，將上述兩種方法的結果結合進行分析，對于基層不具備分枝桿菌基因分型條件的醫療單位早期診斷NTM感染具有一定意義。

本研究結果顯示，用FQ-PCR法檢測115份涂陽痰標本，有9份NTM陰性（涂片結果陽性而FQ-PCR法結果陰性），占涂陽標本數的7.83%，培養法鑒定有10份NTM陽性，占涂陽標本數的8.70%。據梁莉等[5]報道，上海市1998—2004年NTM感染占分枝桿菌屬培養陽性率分別為1.49%、1.17%、1.98%、2.46%、2.66%、2.72%、3.00%，基本呈上升趨勢。陜西省結核病防治院王智存、鄒遠嫵等[6-7]報道，陜西省2012—2013年NTM感染占分枝桿菌培養陽性率為7%～16.9%。本次研究結果顯示，平湖地區NTM感染占分枝桿菌培養陽性率為10.3%，表明NTM感染在平湖市分枝桿菌肺病中占有一定比例，NTM的大多數菌種對治療MTB的藥物呈現高耐藥[5-10]，容易導致臨床治療失敗。快速、準確區分MTB與NTM感染對于結核病的診治非常必要，對于FQ-PCR法提示為NTM感染的肺病病人，建議及早開展菌型鑒定及藥物敏感性試驗以便進行進一步的治療。

本次研究結果中，痰培養結果陽性，而實時熒光定量PCR法陰性的2份標本，除了檢測方法靈敏度因素外，還可能與檢測時取痰樣的部位有關，另據文獻報道，在國內發現有IS6110單拷貝和零拷貝結核分枝桿菌菌株[11]，而本次研究中所用實時熒光定量PCR法檢測的靶序列即為IS6110，這也可能是導致實時熒光定量PCR法檢測結果陰性的因素之一。

FQ-PCR法陽性而培養鑒定法陰性的21份標本中，除了10份鑒定為NTM外，剩余的11份可能與培養法的靈敏度及培養過程中污染雜菌有關，也有可能與痰中的抗酸桿菌是死菌有關。本次研究結果中，經培養及PNB/TCH試驗鑒定，屬于NTM的10份標本，其中6份實時熒光定量PCR法檢測結果為結核分枝桿菌陽性，可能存在混合感染，導致痰培養時只有優勢菌種生長。此外，由于菌種鑒定使用的是PNB/TCH試驗，未最終鑒定到種的水平，根據浙江省疾病預防控制中心柳正衛等[12]報道，用DNA微陣列芯片法和16sRNA測序法對70株PNB/TCH試驗初步鑒定為NTM的菌株進行菌種鑒定，結果61.43%為結核分枝桿菌，其余38.57%為NTM。李國利等[13]報道，以PCR-反向核酸探針雜交和PCR-DNA測序結果為鑒定標準， 264株NTM菌株中233（88% ）株PNB生長試驗為陽性， 其余31株（12% ）為陰性，認為僅應用PNB生長試驗鑒別結核分枝桿菌與NTM存在局限性。

參考文獻

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基金項目：平湖市科技發展計劃項目（2012-62）

【作者簡介】陸飛越（1979—），女，副主任技師 （收稿日期：2015-04-29）