游離二氧化硅所致肺成纖維細胞轉分化過程中DNA甲基化差異基因的MeDIP-seq檢測*

侯建永，姚 武，郝長付

鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001

游離二氧化硅所致肺成纖維細胞轉分化過程中DNA甲基化差異基因的MeDIP-seq檢測*

侯建永，姚 武，郝長付#

鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室 鄭州 450001

#通信作者，男，1979年10月生，博士，副教授，研究方向：塵肺病的研究與防治，E-mail：haochangfu@163.com

矽肺；DNA甲基化；甲基化DNA免疫共沉淀測序

目的：檢測游離二氧化硅所致肺成纖維細胞轉分化過程中可能存在的DNA甲基化差異基因并探討其可能作用機制。方法：原代培養肺成纖維細胞和肺泡巨噬細胞，建立共培養的矽肺體外模型，采用甲基化DNA免疫共沉淀測序技術檢測分析不同染毒時間(0、24、48 h)的肺成纖維細胞之間的DNA甲基化差異基因，并采用DAVID工具對檢測到的甲基化差異基因進行KEGG的通路富集分析。結果：共發現8 791個基因的DNA甲基化程度在3個染毒時間組中均存在差異，DAVID工具分析發現這些差異主要集中在代謝、環境信息過程、細胞過程、生物體系統、人類疾病相關通路等通路中。結論：矽肺形成過程中存在大量DNA甲基化程度發生改變的基因，且這些基因涉及多個通路。

塵肺病是由于生產過程中長期吸入生產性粉塵,粉塵在肺內潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病。塵肺病是職業病中所占比例最高的疾病，一直以來影響著發病者的生活質量和社會的經濟發展[1]。矽肺是由于長期吸入含游離二氧化硅的粉塵引起的職業性肺疾病，通常表現為持續的炎癥反應、成纖維細胞增生、過量的膠原沉積，最終導致肺間質纖維化[2]。游離二氧化硅粉塵致肺纖維化作用最強，矽肺也是塵肺病中進展最快、死亡率最高的一種。報道[3-5]顯示目前國內新發塵肺病種類主要是矽肺和煤工塵肺，以采煤工、掘進工為主，其次是煤炭采掘輔助行業工人。矽肺發生機制雖尚不清楚，但是有研究[6]顯示肺成纖維細胞激活后轉分化為活躍的肌成纖維細胞是纖維化發生的主要變化；所謂轉分化是指一種分化完全的細胞由于某些因素的作用，丟失其原有的表型特點而轉變為其他類型細胞的一種特定的生理病理過程。作者所在的課題組前期研究[7]發現矽肺中肺成纖維細胞DNA甲基化程度降低，因此認為DNA甲基化改變可能是矽肺發生發展的一種調控方式，但并未進行甲基化特異性位點的探索和研究。該研究采用甲基化DNA免疫共沉淀測序(MeDIP-seq)技術對二氧化硅所致肺成纖維細胞轉分化過程中可能存在的DNA甲基化差異基因進行檢測，并探討其可能的作用機制，為進一步研究其表觀遺傳學調控機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 實驗動物：SD大鼠購自河南省實驗動物中心，合格證號No.41003100002516。主要試劑：北京索萊寶有限公司的胎牛血清及高糖培養基，美國ZYMO Research公司的EZ DNA甲基化試劑盒。主要儀器:Heal Force二氧化碳培養箱、PCR擴增儀、Illumina-HiSeq 2000測序儀。

1.2 共培養模型 使用組織塊法提取SD大鼠的肺成纖維細胞，培養至5～8代。采用肺泡灌洗術獲得SD大鼠的肺泡巨噬細胞。參照王永星、曾鑫等[7-8]使用的共培養模型對SD大鼠的肺泡巨噬細胞和肺成纖維細胞進行共培養，構建矽肺體外模型。用100 mg/L的二氧化硅懸濁液進行染毒，分別在染毒后0 h(A1組)、24 h(A2組)、48 h(A3組)收取肺成纖維細胞備用。

1.3 DNA甲基化檢測 提取各組細胞DNA并進行片段化。對片段化DNA進行末端修復后在3’端加“A堿基”，然后連接測序接頭。用DNA甲基化特異抗體對連接純化產物進行甲基化位點IP富集，IP富集產物進行PCR擴增。用20 g/L的TAE瓊脂糖凝膠145 V電泳105 min，將目標區域的PCR產物切膠純化。用2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip(Agilent公司)判斷PCR產物片段大小是否符合后續測序的要求。合格的PCR產物片段用Illumina-HiSeq 2000測序儀測序。得出的數據經過處理后轉化成DNA甲基化差異數據，并定義甲基化表達變化倍數在2倍以上且P<0.05者為DNA甲基化差異基因。

1.4 通路分析 利用DAVID工具對檢測到的DNA甲基化差異基因進行KEGG數據庫通路富集分析。

2 結果

2.1 DNA甲基化差異基因總體結果 經過數據的最初期處理和基因組定位后，共得到差異轉錄本71 455個，對應的惟一DNA甲基化差異基因有16 292個，其中A1與A2組間比較有13 311個，A2與A3組間比較有13 753個，A1與A3組間比較有13 417個，共有8 791個甲基化差異基因在3個組中都存在(圖1)。

A1、A2、A3：分別代表A1組、A2組和A3組。圖1 不同組間DNA甲基化差異基因的分析

2.2 DNA甲基化差異基因的KEGG通路分析 將共同表達的8 791個DNA甲基化差異基因錄入KEGG數據庫中，有2 215個基因匹配到了KEGG的通路中，以P<0.005、Benjamini<0.05為顯著富集的原則[9-10]，共有5大類通路被發現，其中包括代謝、環境信息過程、細胞過程、生物體系統、人類疾病相關通路等通路。代謝通路中，嘌呤代謝集中的基因最多；環境信息過程中以MAPK信號通路集中的基因最多，其次是鈣信號通路和Wnt信號通路；細胞過程相關通路中基因主要集中在了黏著斑和肌動蛋白細胞骨架調節的通路中；生物體系統中基因主要集中在軸突導向等與神經突觸形成有關的通路中；人類疾病相關通路中基因大部分集中在與癌癥有關的通路中。見表1。

表1 DNA甲基化差異基因的KEGG通路分析

3 討論

以往關于游離二氧化硅所致矽肺的成纖維細胞轉分化的甲基化研究多集中于單個基因的甲基化狀態或者全基因組甲基化水平整體的檢測，缺少全基因組中特異性甲基化位點的檢測。該研究中作者通過MeDIP-seq法檢測游離二氧化硅所致肺成纖維細胞轉分化過程中的DNA甲基化差異基因并探討其可能的機制，為尋找可能的干預位點和機制研究提供依據。

該研究應用成熟的細胞共培養模型對矽肺形成中的DNA甲基化進行研究，采用MeDIP-seq技術檢測分析不同染毒時間(0、24、48 h)的肺成纖維細胞間的DNA甲基化差異基因，結果共發現16 292個DNA甲基化差異基因，其中有8 791個基因在3組中都存在，這說明矽肺形成的過程中可能涉及多個基因甲基化的改變，與研究[11]結果相同。

為進一步了解游離二氧化硅所致矽肺前期變化可能涉及的生物學過程和通路，探討在此過程中可能存在的機制，作者使用DAVID工具的KEGG數據庫對獲得的8 791個DNA甲基化差異基因進行通路分析。KEGG(京都基因與基因組百科全書)是基因組破譯方面的數據庫，包括：PATHWAY、GENES/SSDB/KO和COMPOUND/GLYCAN/REACTION數據庫等模塊。PATHWAY數據庫整合當前在分子互動網絡如通路、聯合體的知識，GENES/SSDB/KO數據庫提供在基因組計劃中出現的基因和蛋白質的相關知識，COMPOUND/GLYCAN/REACTION數據庫提供生化復合物及反應方面的知識。該研究利用KEGG PATHWAY對DNA甲基化差異基因進行了通路分析，結果發現這些基因主要集中在代謝、環境信息過程、細胞過程、生物體系統、人類疾病相關通路等5個大類的通路中。

代謝通路主要集中在嘌呤、肌醇磷酸鹽、脂肪酸和丙酸等的代謝過程中，以嘌呤代謝中集中的基因最多，這可能與矽肺形成中基因的甲基化和去甲基化活動過程中碳的代謝有關[12]，細胞中與碳代謝最相關的是能量的變化，由此可以推測矽肺的發生可能與成纖維細胞的能量變化有關。環境信息過程主要集中在ECM與受體相互作用、MAPK信號通路、磷脂酰肌醇信號通路、ErbB信號通路、鈣信號通路、ABC轉運體、Wnt信號通路等信號通路中，這其中包括與細胞生長、增殖和凋亡相關的多個重要的信號通路，比如MAPK、Wnt、ErbB信號通路等，這些已經被證實在細胞的增殖和凋亡中有重要作用[13-16]，對這些通路及其中包含基因的研究可能為解釋矽肺的形成機制提供思路。鈣信號通路富集的基因數量僅次于MAPK通路，這說明在此過程中有大量的鈣離子參與其中，這可能是矽肺形成的多個學說中“鈣超載”學說的新的證據。在細胞過程通路中，主要的集中項是黏著斑、黏著連接、縫隙連接、緊密連接等與纖維化進展相關的一些過程，由此可以看出矽肺形成過程中成纖維細胞轉分化后纖維化的主要形式是成纖維細胞與ECM的連接，形成黏著斑造成的。結果中還出現了軸突導向、長時程抑制、長時程增強等與神經突觸形成相關的富集項，這說明成纖維細胞在轉分化中發生了與突觸形成相同的變化。最后的通路富集分類是人類疾病相關通路，大多數通路都是與癌癥有關的通路，如結腸直腸癌、急性髓性白血病、胰腺癌、腎細胞癌、慢性髓性白血病和前列腺癌等通路，表明了矽肺的纖維化進展過程跟癌癥的形成有相似的特點，比如細胞的過量增殖等，并且跟癌癥有著某些通路的重疊，這說明矽肺前期有著癌癥一樣的生理及病理特征，如炎癥等的存在[17]，對矽肺發生發展過程的研究也可能對癌癥的發生發展起一定的提示作用。此次實驗未對所得到的可能通路和基因進行繼續深入研究以確定具體變化，下一步將對所得的通路和基因等進行功能和機制方面的深入研究。

綜上所述，矽肺形成過程中存在大量DNA甲基化程度發生改變的基因，這些基因涉及多個通路，比如MAPK和Wnt等通路，可能在矽肺的形成中起到重要作用，值得進一步深入研究。

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(2016-03-23收稿 責任編輯徐春燕)

Detection of different DNA methylated genes in transdifferentiation of lung fibroblasts caused by free SiO2using MeDIP-seq

HOUJianyong,YAOWu,HAOChangfu

DepartmentofOccupationalHealth，CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

silicosis；DNA methylation；MeDIP-seq

Aim：To examine the different DNA methylated genes and possible mechanism in the transdifferentiation of lung fibroblasts caused by free SiO2. Methods: The primary macrophages and fibroblasts of SD rats were cultured, and then co-cultured. DNA methylation in fibroblasts with different infected time(0,24,48 h) was detected by MeDIP-seq. Results: A total of 8 791 different DNA methylated genes were discovered in all the three groups, and a further more analysis about those genes in KEGG pathway was performed by DAVID. The different DNA methylated genes were found enriched in metabolism, environmental information processing, cellular processes, organismal systems, human diseases pathway,etc. Conclusion: A large number of different DNA methylated genes and pathways exist in the pathogenesis of silicosis, which is valuable for further study.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.002

*國家自然科學基金資助項目 81102109，81472954

R135.2