基于超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的淋巴瘤患者血漿代謝組學(xué)分析*

姚 珂，杜 正，劉 瀛，徐少博，左非非，魏雙艷，徐曉陽，徐 霞#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 鄭州 450001 2)解放軍防化學(xué)院研究生管理大隊 北京 102205

基于超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的淋巴瘤患者血漿代謝組學(xué)分析*

姚 珂1)，杜 正2)，劉 瀛1)，徐少博1)，左非非1)，魏雙艷1)，徐曉陽1)，徐 霞1)#

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 鄭州 450001 2)解放軍防化學(xué)院研究生管理大隊 北京 102205

#通信作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向：藥物分析，E-mail：xuxia@zzu.edu.cn

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；代謝組學(xué)；淋巴瘤；生物標(biāo)志物

目的：篩選淋巴瘤患者血漿特異性生物標(biāo)志物。方法：運用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q Exactive)技術(shù)對12例淋巴瘤患者及12例正常人血漿樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別，分析兩組的代謝差異，并進(jìn)一步篩選差異代謝物。結(jié)果：OPLS-DA模型結(jié)果顯示，淋巴瘤患者與正常人血漿代謝譜有明顯差異,共篩選出8種差異代謝物。與正常人相比，淋巴瘤患者血漿中天冬氨酸、4-吡哆酸含量顯著升高(P<0.05)，L-α-甘油磷脂酰膽堿、亞油酸、癸酰基肉毒堿、苯丙氨酰苯丙氨酸、牛磺酸及蘇糖酸含量顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：應(yīng)用代謝組學(xué)方法篩選到的8種差異代謝物有望成為淋巴瘤的潛在生物標(biāo)志物。

淋巴瘤(lymphoma)原發(fā)于淋巴結(jié)或其他淋巴組織，是淋巴造血系統(tǒng)中最常見的一種惡性腫瘤[1-3]。目前病理組織學(xué)診斷仍然是國際上淋巴瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而由于淋巴瘤具有高度異質(zhì)性，病理結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很容易誤診[4]。提高淋巴瘤治療效果的關(guān)鍵在于早期診斷，而傳統(tǒng)的診斷技術(shù)很難做到這點。因此，尋找準(zhǔn)確、方便的早期診斷方法對于淋巴瘤的治療和預(yù)后評價有極其重要的意義。

代謝組學(xué)(metabonomics)是研究生物體系在受擾動或刺激后其代謝產(chǎn)物的種類、數(shù)量和變化規(guī)律的科學(xué)，它通過先進(jìn)的分析技術(shù)(核磁共振、質(zhì)譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等)對代謝產(chǎn)物的變化進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，將其表達(dá)成為特定的代謝指紋圖譜，并運用化學(xué)計量學(xué)手段對相關(guān)信息進(jìn)行挖掘[5-6]。運用代謝組學(xué)方法對正常人和腫瘤患者的生物樣本進(jìn)行分析，可以找出二者間代謝譜的差異，鑒定并定量分析與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物[7-9]。

常用的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集技術(shù)有核共振波譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀法、高效液相色譜、高效毛細(xì)管電泳法等[10]。該研究利用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q Exactive)技術(shù)對淋巴瘤患者及正常人的血漿樣品進(jìn)行非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，結(jié)合多維及單維統(tǒng)計方法，篩選并鑒定與淋巴瘤相關(guān)的血漿潛在生物標(biāo)志物，為淋巴瘤的早期診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品收集 采集來自鄭州大學(xué)腫瘤醫(yī)院的初治淋巴瘤患者血漿12份，其中男性6份，女性6份，年齡43～77歲。采集來自鄭州大學(xué)醫(yī)院的健康志愿者血漿12份，其中男性8份，女性4份，年齡25～55歲。血漿收集后立即于-80 ℃冰箱凍存。

1.3 超高效液相色譜(UPLC)條件 液相色譜儀為Dionex公司的UltiMate3000，包括液相泵(HPG-3400 SD)、柱溫箱(TCC-3000 SD)和自動進(jìn)樣器(WPS-3000SL)。所有樣品均采用ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)進(jìn)行檢測；柱溫40 ℃；自動進(jìn)樣器溫度為4 ℃；正離子(ESI+)模式下流動相A為水+體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，流動相B為乙腈+體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸；負(fù)離子(ESI-)模式下流動相A為水，流動相B為乙腈。血漿樣品梯度洗脫程序見表1。進(jìn)樣體積為5 μL。

表1 血漿樣品流動相梯度洗脫條件

1.4 質(zhì)譜條件 采用Thermo公司生產(chǎn)的四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q Exactive)，離子源為加熱型電噴霧(HESI)，溫度為300 ℃；正離子和負(fù)離子模式下噴霧電壓分別為3.6、2.5 kV；傳輸毛細(xì)管溫度320 ℃，鞘氣40，輔助氣流速為10；掃描模式為Full MS和Full MS/dd-MS2，質(zhì)量范圍60～900 m/z，一級掃描和二級掃描分辨率分別為70 000、17 500。

1.5 數(shù)據(jù)處理 將UPLC-Q Exactive獲得的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入SIEVE 2.2軟件進(jìn)行峰識別、峰對齊、基線校正和峰面積歸一化法預(yù)處理，之后運用SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型區(qū)分兩組代謝物差異，模型質(zhì)量用R2Y和Q2兩個參數(shù)進(jìn)行評估，其中R2Y表示模型解釋能力，Q2表示模型預(yù)測能力。根據(jù)OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(variable important in projection，VIP)尋找潛在的生物標(biāo)志物，并運用SPSS 19.0進(jìn)行兩獨立樣本t檢驗，滿足VIP>1且P<0.05的變量為潛在的差異化合物。將這些潛在差異化合物的二級譜圖與Metlin、HMDB、KEGG等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對差異化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

2 結(jié)果

2.1 正常人和淋巴瘤患者血漿總離子流圖(TIC)比較 正常人和淋巴瘤患者血漿UPLC-Q Exactive的TIC見圖1，在正離子及負(fù)離子模式下正常人和淋巴瘤患者的TIC圖中均有一些峰存在明顯差異。

上：正離子模式;下：負(fù)離子模式。圖1 淋巴瘤患者和正常人血漿UPLC-Q Exactive的TIC

2.2 OPLS-DA模型分析結(jié)果 運用OPLS-DA分析方法去除與樣品分類無關(guān)的信息，對血漿全譜進(jìn)行模式判別分析，發(fā)現(xiàn)兩組樣本能得到明顯分離。OPLS-DA正離子模式下R2Y=0.933，Q2=0.807；負(fù)離子模式下R2Y=0.891，Q2=0.793；說明模型擬合較好。圖2為正負(fù)兩種離子模式檢測所得數(shù)據(jù)分別經(jīng)OPLS-DA簡化降維后的得分圖。從圖2可見，淋巴瘤患者的代謝譜發(fā)生了明顯改變。

上：正離子模式；下：負(fù)離子模式；綠色：正常人；藍(lán)色：淋巴瘤患者。圖2 基于正常人、淋巴瘤患者血漿代謝輪廓的OPLS-DA得分圖

2.3 潛在生物標(biāo)志物的鑒定 通過VIP篩選并結(jié)合METLIN、KEGG、HMDB等數(shù)據(jù)庫注釋，共得到8個差異代謝物，見表2。差異代謝物主要集中于與多不飽和脂肪酸、氨基酸及脂代謝相關(guān)的通路上(圖3)。

表2 淋巴瘤患者的血漿差異代謝物

1:亞油酸代謝；2:牛磺酸和亞牛磺酸代謝；3:甘油磷脂代謝；4:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；5:初級膽汁酸合成。圖3 代謝通路分析

3 討論

作者運用UPLC-Q Exactive技術(shù)對淋巴瘤患者及正常人血漿樣品進(jìn)行了非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了8個與淋巴瘤代謝異常相關(guān)的代謝物，分別為天冬氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、牛磺酸、亞油酸、L-α-甘油磷脂酰膽堿、癸酰基肉毒堿、4-吡哆酸及蘇糖酸，其中天冬氨酸和4-吡哆酸在淋巴瘤患者血漿中含量下降，其余6種物質(zhì)含量高于正常人。

淋巴瘤患者血漿中天冬氨酸含量增加，苯丙氨酰苯丙氨酸含量減少，這可能是由于淋巴瘤患者蛋白質(zhì)代謝及氨基酸代謝紊亂造成的。大量研究[11-12]表明氨基酸的異常代謝與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移可能增強體內(nèi)的氨基酸代謝，特別是肌肉組織內(nèi)的蛋白質(zhì)降解。

牛磺酸是調(diào)節(jié)機體正常生理活動的活性物質(zhì)，具有維持機體滲透壓平衡、增強細(xì)胞膜抗氧化能力、提高機體免疫力、保護(hù)心肌細(xì)胞等廣泛的生物學(xué)活性[13]。該研究中淋巴瘤患者血漿中牛磺酸含量顯著降低，可能是由于淋巴瘤患者發(fā)生了明顯的代謝異常，細(xì)胞過多攝取或消耗牛磺酸造成的。

多不飽和脂肪酸的產(chǎn)生和腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及腫瘤血管的形成有密切聯(lián)系。該研究發(fā)現(xiàn)淋巴瘤患者血漿中亞油酸含量顯著降低，可能是由于腫瘤細(xì)胞對其過度利用以滿足細(xì)胞的增殖及生長需求，或其生物合成受到抑制造成的。

很多腫瘤相關(guān)疾病的代謝組學(xué)研究均顯示脂代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。L-α-甘油磷脂酰膽堿是磷脂酰膽堿的衍生物，且是膽堿的主要來源，它可以作為磷脂酰膽堿及乙酰膽堿的生物合成前體發(fā)揮作用[14]。在該實驗中，淋巴瘤患者血漿中L-α-甘油磷脂酰膽堿含量顯著降低，可能是由于淋巴瘤患者脂代謝異常造成的。

肉堿主要參與脂肪酸代謝，其主要功能是將脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體進(jìn)行β-氧化，并以酰基肉堿的形式進(jìn)行能量儲備[15]。該研究發(fā)現(xiàn)淋巴瘤患者血漿中癸酰基肉毒堿含量顯著減少，原因可能是腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致脂肪酸的β-氧化上調(diào)。

目前已知的淋巴瘤腫瘤標(biāo)志物主要有乳酸脫氫酶(LDH)、糖類抗原125(CA125)、β2-微球蛋白等[16]。由于標(biāo)志物可能存在于不同的腫瘤中，單一標(biāo)志物對腫瘤的診斷價值有限，因此有必要尋找淋巴瘤相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物。應(yīng)用代謝組學(xué)方法尋找癌癥生物標(biāo)志物在肺癌[17]、胃癌[18]、前列腺癌[19]等領(lǐng)域多有報道，然而其在淋巴瘤研究領(lǐng)域尚未廣泛應(yīng)用。該研究發(fā)現(xiàn)的8個與淋巴瘤有關(guān)的差異代謝物提示多不飽和脂肪酸、氨基酸及脂代謝在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了主要作用，這8個代謝物可能對于臨床上淋巴瘤的早期診斷有重要意義。

[1]SUN R，MEDEIROS J，YOUNG H.Diagnostic and predictive biomarkers for lymphoma diagnosis and treatment in the era of precision medicine[J].Mod Pathol,2016,29(10):1118

[2]宋琳,邢曉明,冉雯雯,等.664例淋巴瘤臨床病理分析[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2013,29(4):411

[3]王曉卿,徐鋼,李娟,等.淋巴瘤589例構(gòu)成分析[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2011,27(12):1356

[4]陳文俊,宋耕,李澤清,等.影響淋巴瘤病理診斷的臨床因素分析[J].中華疾病控制雜志,2016,20(7):721

[5]BU Q,HUANG Y,YAN G,et al.Metabolomics: a revolution for novel cancer marker identification[J].Comb Chem High Throughput Screen,2012,15(3):266

[6]PATEL NR,MCPHAIL MJ,SHARIFF MI,et al.Biofluid metabonomics using H-1 NMR spectroscopy: the road to biomarker discovery in gastroenterology and hepatology[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2012,6(2):239

[7]PUTLURI N,SHOJAIE A,VASU VT,et al.Metabolomic profiling reveals potential markers and bioprocesses altered in bladder cancer progression[J].Cancer Res,2011,71(24):7376

[8]LIANG Q,WANG C,LI B.Metabolomic analysis using liquid chromatography/mass spectrometry for gastric cancer[J].Appl Biochem Biotechnol,2015,176(8):2170

[9]周紅光，陳海彬，俞曉憶，等.代謝組學(xué)在惡性腫瘤早期診斷中的應(yīng)用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2013,39(1)：184

[10]梅亞波，封志純.代謝組學(xué)在兒科危重癥領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011,36(6)：676

[11]聶大紅,唐剛?cè)A.腫瘤氨基酸代謝PET顯像研究進(jìn)展[J].同位素,2015,28(4):214

[12]巴吐爾·買買提明,哈木拉提·吾甫爾,孔彬,等.基于HPLC的維醫(yī)“異病同證”腫瘤患者血漿氨基酸代謝研究[J].中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,39(6):558

[13]王輝,趙志華,徐國權(quán),等.耐藥口腔鱗癌Tca8113胞外代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2016,38(4):396

[14]ZHANG KY,WANG XG,HUANG JH,et al.Purification of L-alpha glycerylphosphorylcholine by column chromatography[J].J Chromatogr A,2012,1220(2):108

[15]余欣尉,吳謙,呂望,等.基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的肺癌細(xì)胞代謝組學(xué)分析[J].色譜,2013,31(7):691

[16]樊璠,徐笑紅,陳文虎.非霍奇金淋巴瘤患者血清TNF-α、CA125、β2-MG、LDH水平及臨床意義[J].腫瘤學(xué)雜志,2012,18(10):780

[17]MIYAMOTO S,TAYLOR SL,BARUPAL DK,et al.Systemic metabolomic changes in blood samples of lung cancer patients identified by gas chromatography time-of-flight mass spectrometry[J].Metabolites,2015,5(2):192

[18]CHAN AW,GILL RS,SCHILLER D,et al.Potential role of metabolomics in diagnosis and surveillance of gastric cancer.[J].World J Gastroenterol,2014, 20(36):12874

[19]ZANG X, JONES CM,LONG TQ,et al.Feasibility of detecting prostate cancer by ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry serum metabolomics[J].J Proteome Res,2014,13(7):3444

(2016-07-29收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry based plasma metabonomics for patients with lymphoma

YAOKe1),DUZheng2),LIUYing1),XUShaobo1),ZUOFeifei1),WEIShuangyan1),XUXiaoyang1),XUXia1)

1)DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)GraduatesAdministrationBrigade,InstituteofChemicalDefenceofPLA,Beijing102205

UPLC-MS;metabonomics;lymphoma;biomarker

Aim: To explore the potential biomarkers of lymphoma. Methods: Ultra high performance liquid chromatography-Q Exactive orbit trap high-resolution mass spectrometry was applied to process the plasma samples of 12 lymphoma patients as well as 12 healthy volunteers. Orthogonal to partial least squares discriminant analysis was performed to identify the differences in metabolic profiles between the two groups and further to select potential biomarkers related to lymphoma. Results: A significant distinction in the metabolic profiles between lymphoma patients and healthy volunteers was yielded by multivariate statistical analysis and 8 metabolites were found. Compared with healthy controls, the contents of aspartic acid and 4-pyridoxate were significantly higher in plasma of lymphoma patients(P<0.05), while the contents of L-α-glycerophosphorylcholine,linoleic acid,decanoyl carnitine,phenylalany-lphenylalanine,taurine and threonic acid were obviously lower(P<0.05).Conclusion: The 8 metabolites found via metabonomics might be potential biomarkers associated to lymphoma.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.006

*河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目 142300410085

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