阿昔替尼聯合塞來昔布體外抗胃癌細胞BGC-823和SNU-5增殖及抗血管生成作用觀察

黃照茹，張連峰，周 琳

鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

阿昔替尼聯合塞來昔布體外抗胃癌細胞BGC-823和SNU-5增殖及抗血管生成作用觀察

黃照茹，張連峰，周 琳#

鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

#通信作者，女，1977年7月生，博士，副主任醫師，副教授，研究方向：胰腺疾病的基礎與臨床，E-mail：ZL372@126.com

塞來昔布；阿昔替尼；胃癌；聯合用藥；BGC-823細胞;SNU-5細胞

目的：探索阿昔替尼(Ax)和塞來昔布(Cel)在胃癌細胞株BGC-823和SNU-5的聯合效應及對新生血管形成的影響。方法：SRB法測定10 nmol/L Cel和1 nmol/L Ax以及聯合用藥對BGC-823細胞增殖的抑制作用，CCK-8法檢測Cel和Ax以及聯合用藥對SNU-5細胞增殖的抑制作用，Matrial膠體外管腔形成法檢測藥物對于新生血管的影響。結果：在BGC-823和SNU-5細胞株中，Cel和Ax單藥均可抑制BGC-823和SNU-5細胞的增殖，聯合用藥組的細胞生長抑制率高于Cel和Ax單藥組，聯合用藥指數<1。Cel和Ax單藥組對HUVEC細胞的管腔形成系數分別為(0.86±0.03)和(0.83±0.01)，聯合這2種藥物之后，管腔形成系數下降為(0.67±0.02)(P<0.05)。結論：Cel和Ax的聯合用藥方案不僅比單一用藥有更高的細胞生長抑制率，并且還具有協同抑制新生血管形成的作用。

胃癌在所有惡性腫瘤中的致死率排第2，其5 a生存率不到25%[1]，新診斷的患者中有70%都有局部的侵襲或者遠處轉移，預后很差[2]。VEGFR在腫瘤組織中的高表達逐漸被人們認識到，于是針對VEGF/VEGFR這個通路的抑制劑不斷地被用于腫瘤的治療,例如，阿昔替尼(axitinib，Ax)作為2012年上市的新藥，在臨床上被用于晚期腎癌的治療。環氧合酶-2(COX-2)是一種可誘導的酶，它參與了腫瘤的形成，并且它上調的程度是決定腫瘤預后的重要因素[3]。除此之外，COX-2還通過多種途徑參與胃腸系統腫瘤的形成[4]。最近還有研究[5]發現COX-2和多重耐藥(MDR)有關，它的拮抗劑可以逆轉MDR現象。塞來昔布(celecoxib，Cel)是一種新型的COX-2選擇性抑制劑，其臨床常用于風濕性關節炎和類風濕關節炎的治療。Cel和各種常用化療藥合用于胃癌也被證實是有效的[6]。作者將Ax與Cel聯合用于胃癌細胞株，在體外獲得了很好的協同抑制作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人胃癌細胞株BGC-823和SNU-5保存于鄭州大學腫瘤中心實驗室；Ax和Cel購于上海藍木化工有限公司；RPMI 1640培養液、IMDM培養基及胎牛血清為美國Gibco公司產品；磺酰羅丹明B(SRB)為美國Sigma公司產品；CCK-8(日本Dojindo公司)；人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)及其培養液購于德國PromoCell公司。

1.2 實驗分組 實驗分為空白對照組、10 nmol/L Cel組、1 nmol/L Ax組和10 nmol/L Cel+1 nmol/L Ax組。

1.3 SRB比色法檢測BGC-823細胞的生長抑制率 將BGC-823細胞懸液按每孔3 000個的密度在96孔板中培養24 h，將稀釋好的化合物加入培養液中，37 ℃、體積分數5% CO2培養72 h。倒掉培養液后，每孔加入100 μL預冷的體積分數10%三氯乙酸溶液，4 ℃放置2 h固定細胞。洗去固定液并晾干，然后每孔加入100 μL SRB溶液染色，室溫放置30 min，用體積分數1%的乙酸溶液洗去未結合染料。晾干96孔板，加入150 μL 非緩沖Tris-Base堿液溶解染料并振蕩后，采用酶聯免疫檢測儀于540 nm波長處測定每孔OD值,計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.4 CCK-8比色法檢測SNU-5細胞的生長抑制率

將SNU-5細胞按每孔5 000個的密度接種于96孔板中，將稀釋好的化合物加入培養液，培養72 h。向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續在37 ℃孵育4 h，用酶聯免疫檢測儀于450 nm波長讀取每孔OD值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.5 Matrial膠體外管腔形成法檢測藥物對新生血管形成的影響 將70 μL融化了的Matrial膠加于96孔板中，放置于37 ℃培養箱待其凝固。每孔加入含20 000個HUVEC的懸液，同時加入稀釋好的藥物。37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養4 h后，100倍相差顯微鏡下觀察各組血管腔形成情況，按下列公式計算管腔系數：管腔系數=實驗組管腔數量/空白對照組管腔數量。為了排除細胞死亡對管腔形成的影響，同步用SRB法觀察藥物作用于HUVEC 4 h 對細胞增殖的影響。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.6 Compusyn軟件分析 應用Compusyn 軟件計算協同效應，該軟件應用Chou-Talalay聯合指數法計算2種或2種以上的化合物之間的作用。在一定的細胞生長抑制率時，D1和D2分別表示兩者聯用時化合物1和化合物2的濃度，DX1和DX2分別表示為了達到相同的細胞生長抑制率單用化合物1和化合物2的濃度。最終聯合用藥指數(combination index，CI)通過以下公式計算：CI=(D1/DX1)+(D2/DX2)。CI<1表示2種藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用是協同的，CI>1表示拮抗。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0進行數據分析，不同組間體外管腔形成系數的比較采用2×2析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Ax和Cel聯合用藥對胃癌細胞株的抑制作用

作用于BGC-823細胞時，不論細胞生長抑制率的變化，CI均<1。而作用于SNU-5細胞，當細胞生長抑制率≥0.2時，CI<1；當細胞生長抑制率=0.1時，CI>1。

2.2 Ax和Cel單用或聯合用藥對Matrial膠體外管腔形成的影響 結果見表1。同時，形成管腔的形態也受到了影響，空白對照組形成的管腔小而密，單用Cel和Ax時形成的管腔較大且疏松，聯合用藥時管腔最大且疏松(圖1)。

表1 各組管腔形成系數比較

FCel=15.959，FAx=4.242，F交互=9.804，P均<0.05。

A：空白對照組；B:10 nmol/L Cel組；C:1 nmol/L Ax組；D:10 nmol/L Cel+1 nmol/L Ax組。圖1 各組Matrial膠體外管腔形成觀察(×100)

3 討論

胃癌在過去的30 a里發病率不斷增長，對中國人的健康產生了嚴重的威脅。臨床上，進展期胃癌最常用的聯合用藥方案是氟尿嘧啶和順鉑，但是仍然得不到滿意的療效[7]。到目前為止，即使酪氨酸激酶在胃癌的動物模型中被證實具有顯著的抗腫瘤活性，但是仍然沒有被用在人的胃癌治療中。Ax是繼貝伐單抗和索拉菲尼之后的新型血管生成抑制劑，其在胃癌中單用或者聯合常用化療藥物具有較大的潛在活性。胃癌除了高表達VEGFR外還高表達COX-2[8]。Cel是選擇性COX-2抑制劑，目前發現Cel可以在體外抑制多種腫瘤細胞增殖[9]。考慮到Ax單獨用或者聯用其他細胞毒類藥物都具有很好的抗腫瘤活性，而且胃癌確實需要有效的聯合用藥方案，于是作者在胃癌的體外研究中聯合使用了Ax和Cel。

該研究采用了Ax和Cel單藥以及聯合用藥作用于胃癌BGC-823和SNU-5細胞，結果發現作用于BGC-823細胞時CI<1，表明聯合用藥在BGC-823細胞具有協同作用。而作用于SNU-5細胞時，在細胞生長抑制率=0.1時，CI>1，說明這2種藥物在較低細胞生長抑制率的時候并不具有協同作用；在細胞生長抑制率≥0.2時，CI<1。至于BGC-823和SNU-5有不同的聯合效應有待于進一步的探索。當用于抑制Matrial膠體外管腔形成時，單用10 nmol/L的Cel和1 nmol/L的Ax的管腔形成系數分別為(0.86±0.03)及(0.83±0.01)，而聯合用藥組的管腔形成系數為(0.67±0.02)，證明聯合用藥組的管腔形成抑制明顯增加。作者未來將在雞胚尿囊膜實驗和裸鼠動物模型上進一步驗證聯合之后的抗血管生成效益，并探索它的機制。

[1]FERLAY J,SHIN HR,BRAY F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893

[2]YU J,GAO J,LU Z,et al.Serum levels of TUBB3 correlate with clinical outcome in Chinese patients with advanced gastric cancer receiving first-line paclitaxel plus capecitabine[J].Med Oncol,2012,29(5):3029

[3]QIU ZQ,QIU ZR.Sensitivity of gastric cancer cells to chemotherapy drugs in elderly patients and its correlation with cyclooxygenase-2 expression[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(8):3447

[4]SIERRA JC,HOBBS S,CHATURVEDI R,et al.Induction of COX-2 expression by Helicobacter pylori is mediated by activation of epidermal growth factor receptor in gastric epithelial cells[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2013,305(2):G196

[5]LIU J,HUANG XE,TIAN GY,et al.Phase Ⅱ study on safety and efficacy of Yadanzi?(Javanica oil emulsion injection) combined with chemotherapy for patients with gastric cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(3):2009

[6]XU HB,SHEN FM,LV QZ.Celecoxib enhanced the cytotoxic effect of cisplatin in drug-resistant human gastric cancer cells by inhibition of cyclooxygenase-2[J].Eur J Pharmacol,2015,769:1

[7]KOIZUMI W,NARAHARA H,HARA T,et al.S-1 plus cisplatin versus S-1 alone for first-line treatment of advanced gastric cancer(SPIRITS trial): a phase Ⅲ trial[J].Lancet Oncol,2008,9(3):215

[8]JOO YE,CHUNG IJ,PARK YK,et al.Expression of cyclooxygenase-2, p53 and Ki-67 in gastric cancer[J].J Korean Med Sci,2006,21(5):871

[9]KIM YY,LEE EJ,KIM YK,et al.Anti-cancer effects of celecoxib in head and neck carcinoma[J].Mol Cells,2010,29(2):185

(2016-01-30收稿 責任編輯姜春霞)

Combination efficacy of axitinib and celecoxib on proliferation of gastric cancer cells BGC-823 and SNU-5 and its antiangiogenesis effect

HUANGZhaoru,ZHANGLianfeng，ZHOULin

DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

celecoxib;axitinib;gastric cancer;combination therapy；BGC-823 cell;SNU-5 cell

Aim: To explore the combination efficacy of axitinib(Ax) and celecoxib(Cel) on the proliferation of gastric cancer cell lines BGC-823 and SNU-5 and antiangiogenesis effect. Methods: SRB and CCK-8 methods were used to assess the effect of 10 nmol/L Cel and 1 nmol/L Ax on the proliferation of BGC-823 and SNU-5,respectively. Capillary formation was detected by Matrial-plug assayinvitro.Results: SRB and CCK-8 assay showed that Cel and Ax inhibited the proliferation of BGC-823 and SNU-5. The inhibitory rate of combined treatment with Cel and Ax was significantly higher than that of Cel or Ax alone,and the combination index was lower than 1. The vascular indexes of HUVEC treated by Cel and Ax were (0.86±0.03) and (0.83±0.01), respectively, while the combined treatment group was (0.67±0.02)(P<0.05). Conclusion: The combination therapy of Ax and Cel reveals synergetic effect not only in the cell proliferation but also in angiogenesis inhibition.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.009

R735.2