Toll樣受體在大鼠大腦皮層發育過程中的表達*

靳 玫，劉曉利，唐超智，宿俊杰，崔俊偉，王文晟#

1)新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科 河南新鄉 453003 2)河南師范大學生命科學學院 河南新鄉 453007 3)新鄉醫學院第一附屬醫院結核病研究所 河南衛輝 453100

Toll樣受體在大鼠大腦皮層發育過程中的表達*

靳 玫1)，劉曉利2)，唐超智2)，宿俊杰2)，崔俊偉3)，王文晟3)#

1)新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科 河南新鄉 453003 2)河南師范大學生命科學學院 河南新鄉 453007 3)新鄉醫學院第一附屬醫院結核病研究所 河南衛輝 453100

#通信作者，男，1968年2月生，博士，教授，研究方向：神經性疾病，E-mail：2590212765@qq.com

TLR；大腦皮層；大鼠；大腦發育

目的：觀察Toll樣受體(TLR)在大鼠大腦分化和成熟過程中表達的變化。方法：取妊娠16、18 d的胎鼠和新生鼠(n=10)的大腦皮層，用抗體熒光染色檢測Ki-67 和NeuN陽性細胞百分比，同時用實時熒光定量PCR和Western blot法檢測TLR的表達。結果：隨發育的進展，大鼠大腦皮層中 NeuN和Ki-67陽性細胞百分比逐漸降低(P<0.05)，TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的表達逐漸升高(P<0.05)，而TLR5、TLR6和TLR8的表達無明顯變化(P>0.05)。結論：TLR可能參與了神經前體細胞的分化和成熟。

Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)廣泛存在于各種免疫細胞中，在免疫過程中起著重要作用。研究[1-4]發現TLR的表達并不局限于免疫細胞，在中樞神經系統的一些細胞如小神經膠質細胞、星形膠質細胞等中也有表達，參與了多種神經細胞的生長和分化。最近發現[5-8]它還表達于神經前體細胞(neural progenitor cell, NPC)中，并且影響NPC的增殖、分化和自我更新。TLR還參與了神經回路的發展，抑制TLR8活性可導致軸突的延長和減少神經元死亡[9]。雖然腦和免疫細胞都有TLR表達，但參與的信號通路并不相同[10-11]。 作者觀察了各個發育階段大腦皮層中TLR表達的變化，探討各TLR在神經發育過程中的作用，為神經細胞的再生和退化病的治療提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

1.1.2 其他材料 大鼠TLR抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。Western lightning PLUS-ECL (產品號203-12291)購自美國PerkinElmer公司。PE標示的抗Ki-67抗體(產品號3033880)、Alexa flour 488標示的抗NeuN抗體(產品號2003667)購自BD Pharmingen公司。總RNA提取試劑(產品號3220145)、Prime ScriptTMRT試劑盒(產品號BK4002)和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(產品號AK3801 )購自日本TAKARA公司。引物由賽百盛基因技術有限公司合成，序列見表1。

表1 TLR引物

1.2 大腦皮層單細胞懸液的制備 取妊娠16、18 d的胎鼠和出生1 d內的新生鼠各10只處死，取大腦皮質，剖離后剪碎，加入預熱好的胰酶反復吹吸幾次，然后轉移到裝有胰酶的離心管中反復吹吸幾次，于37 ℃的細胞培養箱中消化10 min，然后加1 mL 含體積分數10%胎牛血清的培養液充分混勻以終止消化，室溫下1 500 r/min離心5 min，棄上清，加10 mL完全培養基(神經元專用培養基Neurobasal+B27+葡萄糖+青霉素/鏈霉素)混勻，室溫下1 500 r/min離心5 min,將細胞懸液通過100目不銹鋼篩網,過濾后的細胞懸液轉移至50 mL離心管中，室溫下1 500 r/min離心5 min，棄上清，用FACS溶液(1×PBS+體積分數0.2%胎牛血清)調整細胞濃度為3×107mL-1備用。

1.3 大腦皮層中神經元數量和增殖能力的檢測 取100 μL(3×106個細胞)大腦皮層單細胞懸液到離心管，加Ki-67和NeuN抗體混合，室溫培養15 min，用3 mL FACS溶液洗1次，加500 μL含福爾馬林的FACS溶液懸浮，用BD FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，記錄Ki-67和NeuN陽性細胞百分比。

1.4 大腦皮層TLR mRNA的檢測 取妊娠16、18 d和出生1 d內的新生鼠各10只處死，取大腦皮層-80 ℃凍存。取凍存樣品直接加入1 mL Trizol,勻漿后加入200 μL氯仿振搖15 s，室溫靜置3 min,4 ℃12 000 r/min離心15 min，取上清，加入1 mL體積分數95%乙醇，室溫12 000 r/min離心2 min，吸出上清液，用體積分數75%乙醇洗1次后風干，加入DEPC水溶解后定量。反轉錄過程按照試劑盒說明書進行，反應條件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s, 4 ℃∞。實時熒光定量PCR具體操作方法按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書，在LightCycler R480 System擴增儀中進行，擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,45個循環。以β-actin為內參。以2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。

1.5 大腦皮層TLR蛋白的檢測 取凍存的大腦皮層，加入裂解液裂解細胞后離心。取上清用Bradford法定量。取20 μg樣品加入Loading buffer煮沸后用SDS-PAGE進行分離，轉膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST (Tris-HCl 2 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, pH 7.5, 0.1%Tween)進行膜封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗膜3次，加入二抗后室溫孵育1 h，洗滌3次，按照Western lightning PLUS-ECL試劑盒說明顯色成像。 用Image J測量圖片中各目的條帶強度，以目的蛋白與內參β-actin條帶強度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0進行數據分析。3組大鼠大腦皮層中NeuN、Ki-67陽性細胞百分比、TLR mRNA和蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大腦皮層發育過程中神經元數量和增殖能力的變化 NeuN和Ki-67陽性細胞百分比測定結果見表2。表2顯示，胎鼠大腦皮層中NeuN陽性細胞百分比較高，出生后降低；Ki-67陽性細胞百分比則隨發育逐漸降低。

表2 3組大腦皮層中NeuN和Ki-67陽性細胞百分比的比較 %

2.2 大腦皮層發育過程中TLR的表達 見表3、表4。與妊娠16 d胎鼠相比， 新生鼠大腦皮層中的TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9的表達明顯升高，TLR5、TLR6和TLR8的表達變化不顯著；TLR蛋白表達與mRNA表達相吻合。

表3 大腦皮層發育過程中TLR mRNA的表達

表4 大腦皮層發育過程中TLR蛋白的表達

3 討論

研究[12]已證實，TLR在大腦中參與了多種神經細胞的功能，所有TLR在小膠質神經細胞中都有表達，但在其他神經細胞中并非如此。研究各種TLR在大腦皮層中表達的變化對于理解其在大腦皮層的作用有重要意義。

在該研究中，作者發現，隨著胎鼠的發育，尤其是妊娠18 d，大腦皮層中NeuN陽性細胞百分比較高，但出生后逐漸降低；Ki-67陽性細胞百分比亦逐漸降低，新生鼠中具有增殖能力的細胞只有妊娠16 d胎鼠的1/3；說明胚胎后期神經膠質細胞生成增多，導致成熟神經元在大腦皮質中的比例降低。研究結果提示神經元的分化和成熟主要發生在胚胎早期，早于神經膠質細胞。作者觀察到，在大鼠大腦發育過程中，皮層中TLR5、TLR6和TLR8的表達沒有什么變化，說明這3種TLR在神經細胞的增殖、分化過程中作用有限。已有研究[5,13]證實，TLR2、TLR3和TLR4的活化可抑制NPC的增殖。該研究也觀察到，在大鼠大腦發育過程中，皮層中TLR2、TLR3和TLR4的表達逐漸增高，在新生鼠的表達明顯高于妊娠16 d的胎鼠，說明這3種TLR很可能在成熟神經細胞中發揮作用。TLR9可以緩和神經再生損傷，它的缺失可加重癲癇發作時認知能力的下降[14]。雖然有報道TLR7在小膠質神經細胞和神經元中有表達，但在大腦中的作用被局限于病毒細菌感染和中風等過程中的免疫反應[12]。作者雖然觀察到在大鼠大腦發育過程中，皮層中TLR1、TLR7和TLR9的表達也逐漸升高，但其升高的意義還不明確。因此對于TLR7、TLR9在大腦皮層的功能還有待于進一步研究。

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(2016-04-20收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of Toll-like receptors in development of rat cerebral cortex

JINMei1)，LIUXiaoli2)，TANGChaozhi2)，SUJunjie2)，CUIJunwei3)，WANGWensheng3)

1)DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003 2)CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan453007 3)TuberculosisResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Weihui,Henan453100

Toll-like receptor;cerebral cortex;rat;cerebral development

Aim: To observe the changes of Toll-like receptor(TLR) expression in the differentiation and maturation of the rat brain.Methods: Cerebral cortex of fetal rats of 16 and 18 days and neonatal rats(n=10) were collected to detect Ki-67 and NeuN by fluorescent antibody, TLR expression by real-time PCR and Western blot method.Results: With the development of the progress, the percentages of NeuN positive cells and Ki-67 positive cells in the rat cerebral cortex decreased gradually(P<0.05), the expressions of TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7 and TLR9 increased gradually(P<0.05), while the expressions of TLR5, TLR6 and TLR8 had no significant changes(P>0.05). Conclusion: TLR may be involved in the differentiation and maturation of neural progenitor cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.011

*國家自然科學基金面上項目 31170733

R741.02