宮頸癌組織中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達

韓麗萍，劉麗雅，孫曉慧，李 元，余海洋，張慶慶

1)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床重點學科開放實驗室 鄭州 450052 3)安陽市腫瘤醫院婦產科 河南安陽 455000 4)鄭州市中心醫院婦產科 鄭州 450007

宮頸癌組織中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達

韓麗萍1)△，劉麗雅1,2)，孫曉慧3)，李 元1,2)，余海洋4)，張慶慶1,2)

1)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床重點學科開放實驗室 鄭州 450052 3)安陽市腫瘤醫院婦產科 河南安陽 455000 4)鄭州市中心醫院婦產科 鄭州 450007

△女，1969年8月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤與婦科內分泌，E-mail：hanliping0825@163.com

宮頸癌； PD-1；PD-L1；FOXP3

目的：研究宮頸癌組織中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達情況及其與臨床病理特征的關系。方法：采用免疫組織化學SP法檢測64例宮頸癌組織、40例宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)組織、18例正常宮頸組織中PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白的表達。結果：PD-1 、FOXP3蛋白主要表達于腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，PD-L1 蛋白主要表達于宮頸癌細胞及TIL。正常宮頸組織不表達PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白，宮頸癌組織中PD-1的表達顯著高于CIN和正常宮頸組織 (P<0.05) ；宮頸癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白的表達與組織分化程度、FIGO分期有關(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、HPV感染或分型無關(P>0.05)。宮頸癌組織中PD-L1與PD-1蛋白的表達呈正關聯(rS=0.562,P<0.001)。宮頸癌組織中FOXP3與PD-1 、PD-L1蛋白的表達無關聯(rS=0.218和0.257，P>0.05)。結論：人子宮頸癌組織高表達PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白，且與腫瘤的發生發展、浸潤密切相關。

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年來呈現年輕化的趨勢[1]。子宮頸局部微環境免疫監視功能下降是宮頸癌發生發展的重要原因，而腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)尤其 CD8+T 細胞數量減少和免疫無能起關鍵性作用[2]。TIL是存在于腫瘤間質內以T淋巴細胞為主的一種異質性淋巴細胞群體。程序性死亡受體配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)，又稱B7-H1，是免疫反應中極其重要的協同刺激分子。程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)屬于 CD28/CTLA-4 受體亞家族，表達在活化的 T 細胞和 B 細胞上。近來文獻[3]報道，多種惡性腫瘤異常表達 PD-L1，高表達的PD-L1與TIL上的PD-1相結合，抑制了周圍淋巴細胞的活性，從而使腫瘤細胞逃避了免疫系統的監視與攻擊。調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)在免疫穩態的維持中扮演者重要的角色[4]。叉頭翼狀螺旋轉錄因子(forkhead or winged helix transcription factor，FOXP3)目前被認為是Treg細胞獨立的標記物[5]。該研究應用免疫組織化學的方法檢測PD-1、PD-L1、FOXP3 在正常宮頸、宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、宮頸癌組織中的表達情況，探討它們與宮頸癌發生發展的關系，為宮頸癌診斷及治療開拓新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取鄭州大學第一附屬醫院病理科2012年4月至2014年11月手術切除或活檢的蠟塊標本，經3名有經驗的病理醫師確診。宮頸癌標本64例，按國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期35例，Ⅲ、Ⅳ期29例；患者年齡33～66歲，中位年齡48歲；組織學分級：低分化28例，中分化22例，高分化14例。CIN標本40例，其中CIN Ⅰ級10例、CIN Ⅱ級15例、CINⅢ級15例，患者年齡32～54歲，中位年齡42歲。正常宮頸組織18例，患者年齡34～51歲，中位年齡49歲。所有納入對象均未接受過放、化療等。

1.2 主要試劑與來源 小鼠抗人PD-1、FOXP3單克隆濃縮抗體和兔抗人CD3單克隆濃縮抗體均為英國Abcam公司產品，小鼠抗人PD-L1多克隆抗體購自R&D公司，兔/鼠通用型Streptavidin-HRP試劑盒(帶DAB顯色液)和檸檬酸緩沖液均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白表達的免疫組織化學SP法檢測 宮頸癌、CIN、正常宮頸組織均4 μm厚連續切片，按常規方法脫蠟至水并用微波修復抗原。采用免疫組織化學SP法檢測,按試劑說明書進行操作。一抗PD-1(稀釋50倍)、PD-L1(稀釋33倍)、FOXP3(稀釋100倍)、CD3(稀釋150倍)單克隆抗體4 ℃孵育切片過夜，生物素標記的羊抗兔/鼠二抗工作液室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精輕度復染。以PBS代替一抗作為空白對照，采用已知蛋白表達陽性的結腸癌組織石蠟切片作為陽性對照。PD-L1、PD-1 陽性物為棕黃色顆粒，均定位于細胞膜和細胞質；FOXP3陽性物為黑色顆粒，定位于細胞核。每張切片中選取癌細胞數較多的5個高倍視野(×400)，每個視野計數100個細胞。染色強度：無著色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為 2分，棕褐色或黑色記為3分；陽性細胞百分比：無陽性細胞記為0分，陽性細胞小于25%記為1分，陽性細胞數在25%～50%記為2分，陽性細胞數大于50%記為3分。兩項得分相乘，結果 0～1 分為(-)，≥2分為(+)。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，多個樣本率的比較采用χ2檢驗，兩分類變量間的關聯分析采用列聯系數分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同宮頸組織中PD-1、PD-L1和FOXP3蛋白的表達 見圖1和表1。正常宮頸組織無PD-1、PD-L1和FOXP3蛋白的表達。PD-1和FOXP3主要表達于TIL，宮頸癌細胞無表達； PD-L1 主要表達于宮頸癌細胞及TIL。CD3為T淋巴細胞表面標志物，CD3陽性顆粒定位于TIL，TIL為小圓形，核大質少，點樣分布。

A:正常宮頸組織；B:CIN組織；C:宮頸癌組織。圖1 不同宮頸組織中PD-1(1)、PD-L1(2)、FOXP3(3)蛋白的表達(SP,×400)

2.2 PD-1、PD-L1及FOXP3表達與宮頸癌臨床病理特征的關系 見表2。PD-1、PD-L1及FOXP3的表達與宮頸癌患者的年齡、腫瘤直徑及HPV感染或分型無關(P>0.05)，但與宮頸癌FIGO分期、組織學分級有關(P<0.05)。

2.3 宮頸癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3表達的關聯性分析 結果見表3～5。

表2 宮頸癌組織中PD-1、PD-L1及FOXP3表達與臨床病理特征的關系 例(%)

*：校正χ2檢驗。

表3 宮頸癌組織中PD-1與PD-L1的關系 例

χ2=25.562，rS=0.562，P<0.001。

表4 宮頸癌組織中FOXP3與PD-1之間的關系 例

χ2=1.866，rS=0.218，P=0.172。

表5 宮頸癌組織中FOXP3與PD-L1之間的關系 例

χ2=2.788，rS=0.257，P=0.095。

3 討論

宮頸局部微環境免疫監視功能下降及免疫逃逸現象的產生在宮頸癌發生發展中起到重要的作用。腫瘤抗原特異性T細胞的誘導凋亡和無反應性是腫瘤細胞免疫逃逸的主要機制，協同刺激分子及其相應的調節系統參與了這一過程。同時Treg細胞在機體免疫系統中主要發揮負向調節作用，其在宮頸癌的發生和發展中所起的作用逐漸受到了重視。

PD-1屬于免疫球蛋白超家族中的一員。許多腫瘤組織的淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞中均可檢測到 PD-1 蛋白的表達[3]。PD-1表達于人多種類型細胞中，包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、活化的單核細胞、樹突狀細胞[6]。正常人淋巴組織生發中心中的T淋巴細胞表面可以檢測到PD-1的表達[7]。PD-1的結合配體是PD-L1。PD-L1通常表達于腫瘤細胞表面[8]。PD-L1也表達在其他類型的細胞中，如T細胞和B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質干細胞和骨髓來源的肥大細胞[9]。正常情況下，組織細胞表面的 PD-L1 與淋巴細胞表面的 PD-1 結合后，可抑制淋巴細胞功能，誘導活化的淋巴細胞凋亡，從而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中發揮重要作用[10]。PD-L1 與 PD-1 的結合可產生多種生物學作用，如能夠抑制淋巴細胞的增殖和活化、抑制CD4+T 細胞向 Th1 和 Th17 細胞分化、抑制炎性細胞因子的釋放，這些都起到了免疫負調控的作用[11]。

該研究結果表明PD-L1在宮頸癌組織的陽性表達率為81.3%，與Karim 等[12]報道的宮頸癌 PD-L1陽性表達率19%存在差異，原因可能與作者采用不同方法觀察以及宮頸癌患者來源于不同人種有關。該研究結果亦表明PD-1和PD-L1在正常宮頸、宮頸CIN及宮頸癌組織中的表達逐漸升高，可能是PD-L1 與 PD-1結合后抑制了間質中淋巴細胞的功能及活性，從而促進了腫瘤發生發展。同時，作者還發現PD-L1和PD-1在Ⅲ、Ⅳ期宮頸癌組織中的表達較Ⅰ、Ⅱ期宮頸癌組織高，提示PD-1/PD-L1通路在腫瘤的發生發展、浸潤及轉移中的重要作用。Shi等[3]研究發現,PD-1/PD-L1在腫瘤免疫逃逸中起著舉足輕重的作用，而阻斷PD-1/PD-L1通路則會增強CD8+T細胞清除腫瘤的能力。

該研究發現宮頸癌組織中PD-1與PD-L1的表達有正關聯。馬薇等[13]認為肺癌中癌間質PD-L1表達與 PD-1 陽性淋巴細胞浸潤程度呈正相關。吳圣等[14]認為PD-1和PD-L1在胃癌中的表達無顯著相關性。劉書漫等[15]則認為胃癌中 PD-L1 表達與 PD-1 陽性的TIL數目呈負相關性。腫瘤組織中關于PD-1和PD-L1之間的相關性還沒有統一的結論，提示 PD-L1 的受體可能不僅僅只有 PD-1，可能還存在其他受體參與淋巴細胞功能的調控，有待于進一步的研究。

Treg是一類多免疫調節T細胞。Treg細胞可以抑制其他T細胞的活化，阻礙機體的免疫系統對腫瘤的監視[16]，并防止腫瘤相關抗原-抗體的有效的免疫反應，從而為腫瘤細胞的免疫逃逸提供有利環境，促進腫瘤的發展。FOXP3是Treg細胞最特異的標志，參與Treg細胞的激活及功能的調節[17]，是動態免疫平衡調節必不可少的因子。FOXP3缺失是導致自身免疫性疾病的重要因素[18]。以往的研究發現[19-20]，肺、乳腺、卵巢、結腸腫瘤患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平顯著高于健康受試者，且與臨床分期和荷瘤狀態密切相關。該研究發現FOXP3在宮頸癌和CIN組織中表達均高于正常宮頸組織，說明FOXP3+Treg細胞參與了宮頸癌的發生發展過程。Scott等[21]研究也發現FOXP3在宮頸癌及CIN組織中的表達明顯升高，且FOXP3的表達隨著CIN級別的升高而升高。該研究也發現FOXP3與PD-1及PD-L1的表達無關聯，另外該研究發現PD-1、PD-L1和FOXP3與患者HPV感染狀態無關，可能是與研究樣本數較少有關。

綜上所述，PD-1、PD-L1和FOXP3在宮頸癌的發生發展中起到了一定的作用。PD-L1和PD-1分子有望成為有效的抗宮頸癌免疫治療靶點，但PD-L1 與 PD-1 在腫瘤免疫逃逸中的調控機制尚未完全闡明，需要進一步的研究證實。而FOXP3與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關，已成為腫瘤研究中的重要因子，有望成為宮頸癌篩查及診療的重要標志物。

[1]JEMAL A,BRAY F,CENTER MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69

[2]JAYSHREE RS,SREENIVAS A,TESSY M,et al.Cell intrinsic extrinsic factors in cervical carcinogenesis[J].Indian J Med Res,2009,130(3):286

[3]SHI F,SHI M,ZENG Z,et al.PD-1 and PD-L1 upregulation promotes CD8(+) T-cell apoptosis and postoperative recurrence in hepatocellular carcinoma patients[J].Int J Cancer,2011,128(4):887

[4]GERSHON RK.A disquisition on suppressor T cells[J].Transplant Rev,1975,26:170

[5]VAN DER BURG SH,PIERSMA SJ,DE JONG A,et al.Association of cervical cancer with the presence of CD4+regulatory T cells specific for human papillomavirus antigens[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(29):12087

[6]KEIR ME,BUTTE MJ,FREEMAN GJ,et al.PD-1 and its ligands in tolerance and immunity[J].Annu Rev Immunol,2008,26:677

[7]DORFMAN DM,BROWN JA,SHAHSAFAEI A,et al.Programmed death-1 (PD-1) is a marker of germinal center-associated T cells and angioimmunoblastic T-cell lymphoma[J].Am J Surg Pathol,2006,30(7):802

[8]OHAEGBULAM KC,ASSAL A,LAZAR-MOLNAR E,et al.Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway[J].Trends Mol Med,2015,21(1):24

[9]YAMAZAKI T,AKIBA H,IWAI H,et al.Expression of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC[J].J Immunol,2002,169(10):5538

[10]LI B,VAN ROEY M,WANG CY,et al.Anti-programmed death-1 synergizes with granulocyte macrophage colony-stimulating factor-secreting tumor cell immunotherapy providing therapeutic benefit to mice with established tumors[J].Clin Cancer Res,2009,15(5):1623

[11]DULOS J,CARVEN GJ,VAN BOXTEL SJ,et al.PD-1 blockade augments Th1 and Th17 and suppresses Th2 responses in peripheral blood from patients with prostate and advanced melanoma cancer[J].J Immunother,2012,35(2):169

[12]KARIM Rezaul,JORDANOVA S,PIERSMA J,et al.Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma[J].Clin Cancer Res,2009,15(20):6341

[13]馬薇,羅殿中,陳源,等.PD-L1和PD-1在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義[J].實用醫學雜志,2011,27(9):1551

[14]吳圣,邵婧怡,王芳,等.PD-L1和 PD-1在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J].安徽醫科大學學報,2015(6):821

[15]劉書漫,孟青,張欽憲,等.B7-H1及其受體PD-1在胃癌組織中的表達與意義[J].中華腫瘤雜志,2008,30(3):192

[16]WHITESIDE TL.Regulatory T cell subsets in human cancer: are they regulating for or against tumor progression?[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63(1):67

[17]HORI S,NOMURA T,SAKAGUCHI S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003,299(569):1057

[18]JIN Yonglong,GUAN Songlei,LIU Linlin,et al.Anti-p16 autoantibodies may be a useful biomarker for early diagnosis of esophageal cancer[J].Asia Pac J Clin Oncol,2015,11(4):e37

[19]YE L,GUAN S,ZHANG C,et al.Circulating autoantibody to FOXP3 may be a potential biomarker for esophageal squamous cell carcinoma[J].Tumour Biol,2013,34(3):1873

[20]CUNHA Leite,MORARI Cristina,NONOGAKI Suely,et al.Foxp3 expression is associated with aggressiveness in differentiated thyroid carcinomas[J].Clinics (Sao Paulo),2012,67(5):483

[21]SCOTT ME,MA Y,KUZMICH L,et al.Diminished IFN-gamma and IL-10 and elevated Foxp3 mRNA expression in the cervix are associated with CIN 2 or 3[J].Int J Cancer,2009,124(6):1379

(2016-08-01收稿 責任編輯李沛寰)

Expression and correlation analysis of FOXP3, PD-1 and PD-L1 in the cervical cancer

HANLiping1)，LIULiya1,2),SUNXiaohui3),LIYuan1,2),YUHaiyang4),ZHANGQingqing1,2),

1)DepartmentofGynaecology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan,Zhengzhou450052 3)DepartmentofGynaecology,TumorHospitalofAnyang,Anyang,Henan455000 4)DepartmentofGynaecology,ZhengzhouCentralHospitalAffiliated，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007

cervical cancer；PD-1；PD-L1；FOXP3

Aim: To explore the expression of PD-1, PD-L1 and FOXP3 proteins in human normal cervical tissues, cervical intraepithelial neoplasia，cervical cancer, and their relationship with clinical features. Methods: Immuno-histochemical SP method was used to detect the expressions of PD-1, PD-L1, FOXP3 in tissue obtained from 64 cases of cervical cancer, 40 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN),18 cases of normal cervical tissue. Results: FOXP3, PD-1 was mainly expressed on TIL, PD-L1was mainly expressed in cervical cancer cells and TIL. There were no expression of PD-1, PD-L1,FOXP3 in normal cervical tissues. The positive expression rate of PD-1, PD-L1, FOXP3 in cervical cancer tissues was significantly higher than that in cervical CIN tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05); The expression of PD-1, PD-L1 and FOXP3 in cervical carcinoma was related to the degree of differentiation ，FIGO stage, the difference being statistically significant (P<0.05), and without any correlation with age, tumor size, HPV infection (P>0.05). The expression of PD-L1 and PD-1 in cervical carcinoma cells was positively correlated (rS=0.562,P<0.001). The expression of FOXP3 and PD-1 ，PD-L1 in cervical cancer tissue had no significant correlation(rS=0.218,0.257，P>0.05). Conclusion: The expression of PD-L1 and PD-1 in human cervical cancer tissues is increased, which is closely related to the occurrence, development, infiltration and metastasis of the tumor.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.022

R711.74