芥子氣經(jīng)腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷纖維化指標(biāo)變化*

韓瑋，朱雙雙，貝媛媛，趙建，鐘玉緒，劉菲，趙玉玲，祝筱姬

（1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，山東濟(jì)南250001；2.濰坊醫(yī)學(xué)院研究生處，山東濰坊261042；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；4.解放軍第89醫(yī)院呼吸科，山東濰坊261021）

論著

芥子氣經(jīng)腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷纖維化指標(biāo)變化*

韓瑋1，朱雙雙2，貝媛媛2，趙建3，鐘玉緒3，劉菲4，趙玉玲4，祝筱姬4

（1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，山東濟(jì)南250001；2.濰坊醫(yī)學(xué)院研究生處，山東濰坊261042；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850；4.解放軍第89醫(yī)院呼吸科，山東濰坊261021）

目的經(jīng)腹腔和氣管復(fù)制大鼠芥子氣（SM）急性肺損傷動(dòng)物模型，比較2種大鼠急性肺損傷模型肺纖維化指標(biāo)的差異。方法選取Sprague Dawley大鼠136只，隨機(jī)分為5組。腹腔SM組腹腔內(nèi)注入稀釋的SM 0.1 ml（0.96 LD50=8 mg/kg），氣管SM組氣管內(nèi)注入稀釋的SM 0.1 ml（0.98 LD50=2 mg/kg），腹腔和氣管丙二醇組分別腹腔和氣管內(nèi)注入丙二醇0.1 ml，正常對(duì)照組不做任何處理。采用Masson染色和免疫組織化學(xué)，判斷肺纖維化指標(biāo)變化。結(jié)果①光鏡下見72 h肺泡間隔被染成綠色的膠原纖維增多；②腹腔SM組大鼠肺泡間隔各時(shí)間段基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率分別與氣管SM組比較升高（P＜0.05）；③腹腔SM組大鼠肺泡間隔各時(shí)間段肺泡間隔Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率分別與氣管SM組比較升高（P＜0.05）；④腹腔SM組大鼠肺泡間隔各時(shí)間段肺泡間隔轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、母親DPP同源物7（Smad7）蛋白陽性表達(dá)率分別與氣管SM組比較升高（P＜0.05）。結(jié)論大鼠在經(jīng)腹腔和氣管SM LD50濃度相似的情況下，經(jīng)腹腔途徑肺纖維化指標(biāo)與經(jīng)氣管比較升高，提示SM經(jīng)腹腔途徑更容易誘導(dǎo)肺纖維化。

芥子氣；肺損傷；肺纖維化；大鼠

芥子氣（sulfur mustard，SM）是一種強(qiáng)有力的以細(xì)胞毒為主的雙功能烷化劑，具有誘變和癌變特性[1]。SM損傷最常見的器官是皮膚、呼吸道和眼睛，其中肺損傷所導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征和肺纖維化是致死的重要原因[2]。SM的毒性主要?dú)w屬于對(duì)蛋白的烷化和其親脂性，它能快速穿透靶組織，結(jié)合細(xì)胞中的脂類和核酸導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞毒性[3]。前期筆者在復(fù)制經(jīng)腹腔和氣管SM急性肺損傷動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，對(duì)SM肺損傷的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行了研究[4-6]。本文通過對(duì)肺組織特殊染色和免疫組織化學(xué)，分析比較經(jīng)腹腔和氣管SM急性肺損傷的纖維化指標(biāo)變化，并探討其分子機(jī)制，為抗纖維化靶向治療提供靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1，2-丙二醇溶液由天津致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司提供，Masson染色液由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinases-1，TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2，TIMP-2）、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）及母親DPP同源物7（mothers against decapentaplegic homolog 7，Smad7）蛋白免疫組織化學(xué)試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。冷光源（AXEL-300型，圖特林根，德國），光學(xué)顯微鏡（BX51型，奧林巴斯公司，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性Sprague Dawley大鼠136只（SPF級(jí)，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：0015902），體重280～300 g，年齡15周。

將大鼠分為腹腔SM組（32只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管SM組（32只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對(duì)照組（8只）。SM液（純度＞90％）臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。①氣管途徑染毒動(dòng)物模型復(fù)制：實(shí)驗(yàn)前氣管SM組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05 mg/kg），30 min后腹腔內(nèi)注射鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）實(shí)施麻醉，氣管內(nèi)注入稀釋的SM 0.1 ml（0.98LD50=2mg/kg），氣管丙二醇組注入丙二醇0.1 ml。②腹腔途徑染毒動(dòng)物模型復(fù)制：同上方法實(shí)施麻醉。腹腔SM組大鼠腹腔內(nèi)注入稀釋的SM 0.1 ml（0.96 LD50=8 mg/kg），腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1 ml。正常對(duì)照組不做任何處理。

1.3 觀察指標(biāo)

收集大鼠肺組織標(biāo)本共136份，用10％中性福爾馬林溶液固定標(biāo)本24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，每一個(gè)標(biāo)本切取15份，每5份一組進(jìn)行Masson和免疫組織化學(xué)染色。

1.3.1 Masson染色石蠟切片脫蠟至水，鉻化處理，依次自來水和蒸餾水洗，用Regaud蘇木精染色液染核5～10 min，水洗和蒸餾水洗，用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，1％磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)液染5 min，以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，95％酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.2 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)（SP）法檢測(cè)MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ膠原蛋白、TGF-β1、Smad7蛋白的表達(dá)。石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，滴加兔抗大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、TGF-β1、Smad7單克隆抗體20μl/片，再滴加二抗，DABC顯色，蘇木精襯染，常規(guī)樹脂封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作陽性對(duì)照。

1.3.3 顯微圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0病理細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，將各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7免疫組織化學(xué)染色切片行圖像分析，選取測(cè)量參數(shù)，測(cè)定陽性率和強(qiáng)陽性率，每間隔一個(gè)高倍視野（400倍）選取一個(gè)視野進(jìn)行觀察，每張切片至少觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)算其肺泡間隔陽性細(xì)胞比率（5個(gè)高倍視野的陽性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100％）并計(jì)算其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織Masson染色結(jié)果

腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔可見微量被染成綠色的膠原纖維，24和48 h肺泡間隔可見少量被染成綠色的膠原纖維，72 h肺泡間隔被染成綠色的膠原纖維增多。氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔見微量被染成綠色的膠原纖維分布。見圖1。

2.2 大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ膠原蛋白、TGF-β1、Smad7蛋白的表達(dá)

2.2.1 MMP-2腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達(dá)呈零星分布。見圖2。5組不同時(shí)間的MMP-2蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的MMP-2蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=524.282，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的MMP-2蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 698.015，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的MMP-2蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=264.515，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖3、4。

2.2.2 MMP-9腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48h肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達(dá)呈零星分布。見圖5。5組不同時(shí)間的MMP-9蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的MMP-9蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=363.009，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的MMP-9蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=647.823，P= 0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的MMP-9蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=161.152，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖6、7。

2.2.3 TIMP-1腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔TIMP-1陽性蛋白表達(dá)呈零星分布。見圖8。5組不同時(shí)間的TIMP-1蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的TIMP-1陽性蛋白表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=607.751，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的TIMP-1蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3471.017，P= 0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的TIMP-1蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 289.162，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖9、10。

2.2.4 TIMP-2腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達(dá)呈零星分布。見圖11。5組不同時(shí)間的TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的TIMP-2陽性蛋白表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=341.900，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1540.403，P= 0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 166.807，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖12、13。

2.2.5 Ⅰ型膠原腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)呈零星分布。見圖14。5組不同時(shí)間的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=283.700，P=0.000）；②腹腔SM組與其他4組的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1677.605，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=171.012，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖15、16。

2.2.6 Ⅲ型膠原腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)呈零星分布。見圖17。5組不同時(shí)間的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)間的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 245.616，P=0.000）；②腹腔SM組與其他4組的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 792.061，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=136.851，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖18、19。

2.2.7 TGF-β1腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達(dá)呈零星分布（見圖20）。5組不同時(shí)間的TGF-β1蛋白陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的TGF-β1蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=403.720，P=0.000）。②腹腔SM組與其他4組的TGF-β1蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 034.116，P=0.000）。③腹腔SM組與氣管SM組的TGF-β1蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=189.081，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖21、22。

圖1 大鼠肺泡間隔纖維分布（Masson染色×400）

圖2 大鼠肺泡間隔MMP-2蛋白表達(dá)（×400）

圖3 大鼠肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達(dá)率

圖4 5組大鼠肺泡間隔MMP-2蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖5 大鼠肺泡間隔MMP-9蛋白表達(dá)（×400）

圖6 大鼠肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達(dá)率

圖7 5組大鼠肺泡間隔MMP-9蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖8 大鼠肺泡間隔TIMP-1蛋白表達(dá)（×400）

圖9 大鼠肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達(dá)率

圖10 5組大鼠肺泡間隔TIMP-1蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖11 大鼠肺泡間隔TIMP-2蛋白表達(dá)（×400）

圖12 大鼠肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率

圖13 5組大鼠肺泡間隔TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖14 大鼠肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)（×400）

圖15 大鼠肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率

圖16 5組大鼠肺泡間隔Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖17 大鼠肺泡間隔Ⅲ膠原蛋白表達(dá)（×400）

圖18 大鼠肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率

圖19 5組大鼠肺泡間隔Ⅲ型膠原蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖20 大鼠肺泡間隔TGF-β1蛋白表達(dá)（×400）

圖21 大鼠肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達(dá)率

圖22 5組大鼠肺泡間隔TGF-β1蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖23 大鼠肺泡間隔Smad7蛋白表達(dá)（×400）

2.2.8 Smad7腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達(dá)呈散在分布，24和48 h肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達(dá)聚集成簇分布，72 h肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達(dá)呈密集分布；氣管丙二醇和正常對(duì)照組肺泡間隔Smad7陽性蛋白表達(dá)呈零星分布。見圖23。5組不同時(shí)間的Smad7陽性蛋白表達(dá)率比較，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①腹腔和氣管SM組不同時(shí)間點(diǎn)的Smad7蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 165.499，P= 0.000）；②腹腔SM組與其他4組的Smad7蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3 487.702，P=0.000）；③腹腔SM組與氣管SM組的Smad7蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=563.158，P=0.000），呈遞增趨勢(shì)。見圖24、25。

圖24 大鼠肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達(dá)率

圖25 5組大鼠肺泡間隔Smad7蛋白陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

3 討論

肺纖維化的病理特點(diǎn)是肺泡持續(xù)性損傷和炎癥，細(xì)胞外基質(zhì)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重構(gòu)和膠原過度沉積[7]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，其中MMP-2，MMP-9是降解構(gòu)成肺泡基膜主要成分Ⅳ型膠原的主要酶類。肺纖維化早期以肺泡炎癥為主，肺組織內(nèi)MMP-2和MMP-9活性增強(qiáng)；后期以纖維化為主，肺組織TIMP-1和TIMP-2表達(dá)則明顯增加[8]。MMP-9和TIMP-1參與肺纖維化中肺組織的重構(gòu)。肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞是纖維化早期產(chǎn)生MMP-2的主要細(xì)胞，MMP-2過度活化可能是肺基膜Ⅳ型膠原蛋白降解的主要原因，成為啟動(dòng)肺纖維化的重要機(jī)制。研究表明，Ⅳ型膠原和MMP-9與支氣管上皮細(xì)胞的移行有關(guān)[9]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)Ⅰ型膠原的含量最為豐富，主要分布于支氣管樹和血管樹的周圍，Ⅲ型膠原主要見于肺泡間質(zhì)內(nèi)，包括肺泡壁、小葉間隔，是構(gòu)成肺間質(zhì)膠原的主要成分[10]。TGF-β1是目前認(rèn)為的最強(qiáng)致纖維化因子之一，它可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，是肺纖維化形成和發(fā)展的關(guān)鍵性細(xì)胞因子[11]。MMP-9可參與TGF-β1的激活，此激活過程需依賴細(xì)胞表面上的CD44[12]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MMP-9對(duì)TGF-β1復(fù)合物的裂解作用無需CD44，可能與其他的細(xì)胞表面分子參與激活有關(guān)[13]。TIMP-1也可通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)引發(fā)TGF-β1代謝紊亂，促進(jìn)肺纖維化[14]。Smad蛋白通路是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路，Smad3、Smad4是該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要信號(hào)蛋白，Smad7是一種抑制性的信號(hào)蛋白，在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，SM可誘導(dǎo)肺臟炎癥細(xì)胞浸潤，觸發(fā)MMPs/TIMPs和TGF-β/Smad的調(diào)節(jié)失衡，大量膠原蛋白肺內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化[16-18]。因此，復(fù)制SM經(jīng)腹腔和氣管致急性肺損傷動(dòng)物模型，探索高劑量SM致肺纖維化的分子機(jī)制，對(duì)未來的靶向干預(yù)具有潛在的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，SM經(jīng)腹腔和氣管染毒大鼠72 h后，肺泡間隔被染成綠色的膠原纖維明顯增多。腹腔組不同時(shí)間點(diǎn)的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率與氣管SM組比較升高。腹腔SM組的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率與其他4組比較升高。腹腔SM組的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、TIMP-2蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)與氣管SM組比較，呈遞增趨勢(shì)。腹腔組不同時(shí)間點(diǎn)的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7蛋白陽性表達(dá)率與氣管SM組比較升高。腹腔SM組的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7蛋白陽性表達(dá)率與其他4組比較升高。腹腔SM組的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1、Smad7蛋白陽性表達(dá)率變化趨勢(shì)與氣管SM組比較，呈遞增趨勢(shì)。結(jié)果提示，在高劑量SM致急性肺損傷的早期，肺纖維化指標(biāo)可發(fā)生異常變化，并隨損傷時(shí)間的延長而加重，且腹腔SM組更為明顯。正常肺組織中僅有少量的MMP-2、MMP-9表達(dá)，但在SM誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng)過程中，成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及一些炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞都可產(chǎn)生MMP-2和MMP-9，損傷肺泡基膜，啟動(dòng)肺纖維化的發(fā)生。TIMP-1和TIMP-2作為MMP-2和MMP-9的生理抑制劑，與MMP-2和MMP-9以共價(jià)鍵的形式結(jié)合形成酶原復(fù)合物而特異性抑制MMP-2和MMP-9的活性[19]。本研究提示，肺泡間隔MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)增加，說明肺組織損傷以炎癥反應(yīng)為主。TIMP-1和TIMP-2的蛋白表達(dá)增加，可暗示為一種一過性生理補(bǔ)償。本結(jié)果還揭示一種可能的“遷移或移行”機(jī)制，即MMP-9可促進(jìn)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并有利于肌成纖維細(xì)胞從血管向組織損傷處遷移。與此同時(shí)，還參與中性粒細(xì)胞跨基底膜移行[20-21]。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是肺纖維化的主要靶細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞參與其中，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞，TGF-β1則稱為一種分子性“開關(guān)”[22]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinases，JNK）信號(hào)通路能有效且特異地傳遞應(yīng)答胞外的多種刺激信號(hào)。成纖維細(xì)胞中TGF-β1的激活需要Smad介導(dǎo)的JNK/AP等轉(zhuǎn)錄因子的活化來發(fā)揮作用，JNK則通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子1（transcription activator-1，AP-1）來控制肺纖維化進(jìn)程[23-24]。本研究顯示，肺泡間隔TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增加，提示SM肺損傷早期會(huì)出現(xiàn)分子層面的肺纖維化指標(biāo)變化。Smad7蛋白表達(dá)增加，則是觸發(fā)對(duì)TGF-β1的一種負(fù)反饋機(jī)制[25-26]。TGF-β1的過度表達(dá)是一種病態(tài)反應(yīng)（損傷或炎癥），Smad7可通過對(duì)Ⅰ型受體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制TGF-β1信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和Smad2、3的活性[27-28]。筆者認(rèn)為，在SM肺損傷的炎癥反應(yīng)階段，損傷和炎癥可觸發(fā)MMP-2和MMP-9蛋白的高表達(dá)，繼發(fā)TIMP-1和TIMP-2蛋白的代償性高表達(dá)；TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的高表達(dá)，繼發(fā)Smad7蛋白的代償性高表達(dá)。這些病理和生理性反應(yīng)的存在，促進(jìn)了分子信號(hào)通路失調(diào)的再平衡。大鼠在經(jīng)腹腔和氣管SM LD50濃度相似的情況下，經(jīng)腹腔途徑肺纖維化指標(biāo)與經(jīng)氣管比較升高，提示SM經(jīng)腹腔途徑更容易誘導(dǎo)肺纖維化。本動(dòng)物模型的復(fù)制和分子機(jī)制的探討，為SM誘導(dǎo)急性肺損傷的防治-抗纖維化研究提供可借鑒的靶標(biāo)。

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（張蕾 編輯）

Changes of pulmonary fibrosis indexes due to sulfur mustardinduced acute lung injury in rats via intraperitoneal and tracheal injection*

Wei Han1,Shuang-shuang Zhu2,Yuan-yuan Bei2,Jian Zhao3, Yu-xu Zhong3,Fei Liu4,Yu-ling Zhao4,Xiao-ji Zhu4
(1.Department of Medical Affairs,Jinan Military General Hospital,Jinan,Shandong 250001, China;2.Department of Postgraduate,Weifang Medical College,Weifang,Shandong 261042, China;3.Institute of Pharmacology and Toxicology,Chinese Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China;4.Department of Respiratory Medicine,the 89th Hospital of Chinese PLA,Weifang,Shandong 261021,China)

ObjectiveTo establish rat model of sulfur mustard(SM)-induced acute lung injury via intraperitoneal and tracheal injection,in order to compare the differences of pulmonary fibrosis indexes.MethodsA total of 136 male Sprague Dawley rats were randomly divided into the five groups,i.e.the control group with 8 rats and other four groups(intraperitoneal SM group,intraperitoneal propylene glycol group,tracheal SM group and tracheal propylene glycol group)with 32 rats in each group.The rats in the intraperitoneal SM group were intraperitoneally injected with 0.1 ml diluted SM(0.96 LD50=8 mg/kg),the rats in the tracheal SM group were intratracheallyinjected with 0.1 ml diluted SM(0.98 LD50=2 mg/kg),the rats in the intraperitoneal propylene glycol group and the tracheal propylene glycol group were injected with 0.1 ml propylene glycol through peritoneal cavity and trachea respectively;meanwhile the status quo was kept with the normal control group.SM-induced pulmonary fibrosis indexes were observed by Masson and immunohistochemical staining.ResultsLight microscopic observation confirmed that green-stained collagen fibers increased in the alveolar septa at 72nd h.Significantly higher positive expression rates of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 by immunohistochemical staining in the alveolar septa were detected in the intraperitoneal SM groups compared with those in the tracheal SM groups at each period of time (P＜0.05).The positive expression rates of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen in the alveolar septa in the intraperitoneal SM groups were significantly increased compared with those in the tracheal SM group at each period of time(P＜0.05).Significantly higher positive expression rates of TGF-β1and Smad7 in the alveolar septa were also observed in the intraperitoneal SM group compared with the tracheal SM group at each period of time(P＜0.05).ConclusionsWhen LD50concentration of SM through intraperitoneal injection is similar to that through tracheal injection in rat,the indexes of pulmonary fibrosis are significantly increased after intraperitoneal injection compared with those after tracheal injection,suggesting that SM-induced pulmonary fibrosis can be more easily induced through intraperitoneal injection.

sulfur mustard;lung injury;pulmonary fibrosis;rat

R-332；R563.8

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.001

1005-8982（2017）02-0001-12

2016-05-03

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No：2013ZX09J13103-01B）

祝筱姬，Email：xiaojizhu@163.com