線粒體介導產生的活性氧在血管緊張素Ⅱ誘導的腎臟損害中的作用*

馮苗苗，劉素曉，王小曉，崔琳，謝世陽，沈思，朱明軍，王幼平

（1.河南中醫學院中西醫結合臨床學科，河南鄭州450008；2.河南中醫學院第一附屬醫院，河南鄭州450000）

論著

線粒體介導產生的活性氧在血管緊張素Ⅱ誘導的腎臟損害中的作用*

馮苗苗1，劉素曉2，王小曉2，崔琳2，謝世陽2，沈思2，朱明軍2，王幼平2

（1.河南中醫學院中西醫結合臨床學科，河南鄭州450008；2.河南中醫學院第一附屬醫院，河南鄭州450000）

目的利用特異性的線粒體活性氧清除劑mitoTEMPO，探討線粒體介導產生的活性氧（ROS）在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘發的腎臟損害中的作用。方法通過miniosmotic pump對小鼠皮下灌注AngⅡ復制AngⅡ依賴型高血壓模型，而對照組小鼠僅皮下灌注生理鹽水。AngⅡ依賴型高血壓小鼠分為AngⅡ組和AngⅡ+mitoTEMPO組，分別于皮下注射溶媒和mitoTEMPO。實驗處理4周后，分別檢測小鼠尾動脈收縮壓、尿8-異構前列腺素及24 h白蛋白排泄量、肌酐清除率和腎臟中線粒體所產生ROS含量的變化，并同時對腎臟組織病理學的改變進行分析。結果與對照組比較，AngⅡ組小鼠血壓升高、尿8-異構前列腺素和白蛋白排泄量增加、肌酐清除率下降，腎臟中腎小球硬化指數、腎小管間質損害程度均增加，并伴有線粒體介導產生ROS水平的升高（P＜0.05）。除血壓外，mitoTEMPO能抑制上述病理性變化，從而減輕AngⅡ所誘發的腎臟損害（P＜0.05）。結論在AngⅡ誘發的高血壓過程中，特異性的線粒體活性氧清除劑mitoTEMPO抑制該過程誘發的腎臟損害，并同時伴有腎臟線粒體ROS產生的下降。因此，上述研究結果提示線粒體介導產生的ROS能夠促進AngⅡ誘發的腎臟損害。

血管緊張素Ⅱ；高血壓；腎臟損害；線粒體；活性氧

高血壓是除糖尿病外導致慢性腎臟病（chronic kidney disease）的主要原因之一[1-2]。大量臨床觀察及動物實驗顯示，線粒體功能與慢性腎臟病的發生和發展密切相關[3]。線粒體除主要通過氧化磷酸化合成產生ATP外，其功能還涉及細胞增殖和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生等多種生理及病理過程[3]。因此，當線粒體功能下降時，除ATP合成減少外，通常表現為ROS產生增多，從而造成組織器官的損害。大量研究已發現和證實，NADPH氧化酶介導產生的ROS促進高血壓誘發的腎臟損害[4-5]。本研究擬通過血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導的高血壓小鼠模型探討特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO對腎臟功能以及形態學發生損傷時的影響，從而闡明線粒體介導產生的ROS對AngⅡ誘發的腎臟功能損害的影響作用。

1 材料與方法

1.1 動物

8～9周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。動物許可證號為：SCXK（京）2015-0011。

1.2 試劑

線粒體ROS清除劑mitoTEMPO購自美國EnzoLife Sciences公司，AngⅡ購自美國Sigma公司，ELISA尿蛋白檢測試劑盒購自美國Exocell公司，改良的Jaffe肌酐檢測試劑盒購自美國BioAssay System公司，尿8-異構前列腺素檢測試劑盒購自美國Cayman Chemical公司。

1.3 造模及分組

經1周的適應性飼養以后，對小鼠行皮下注射甲苯噻嗪（4 mg/kg）和氯胺酮（80 mg/kg）混合麻醉劑進行麻醉，于小鼠頸背部皮下包埋miniosmotic pump（Alzetmodel 1004，Durect Corp，Cupertino，CA，美國），分別皮下連續灌注生理鹽水或AngⅡ[1μg/（kg·min）]，持續4周。本實驗小鼠分為以下3組：對照組，經miniosmotic pump皮下灌注生理鹽水；AngⅡ組；AngⅡ+mitoTEMPO組。第2和第3組小鼠，則經miniosmotic pump皮下灌注Ang II誘發高血壓及腎臟損害。另外，針對第2和第3組小鼠，于皮下包埋含AngⅡ的miniosmotic pump時，包埋另1個miniosmotic pump，經該miniosmotic pump皮下注射mitoTEMPO的溶媒或mitoTEMPO[0.7 mg/（kg·d）]。mitoTEMPO溶于生理鹽水。手術后，連續3 d對所有小鼠注射青霉素鈉鹽。本實驗對各組小鼠的觀察周期為4周。

1.4 動脈收縮壓的測定

本實驗依據Tail-cuff體積描記法的原理測定小鼠清醒狀態時的尾動脈收縮壓。手術前及手術后各周，取各組小鼠，于30℃溫箱中加熱10 min，用固定器對其固定，等待小鼠安靜后，利用血壓測定儀（購自美國Visitech System公司，型號為BP-2000）對尾動脈收縮壓連續測定5次，取5次的平均值作為小鼠的動脈收縮壓值。本實驗安排上午10：00～12：00為測定時間。

1.5 尿液及血漿分析

實驗處理后第26天，分別取各組小鼠放于代謝籠中，待其穩定后，收集24 h尿液，并稱小鼠體重。經皮下注射甲苯噻嗪（4 mg/kg）和氯胺酮（80 mg/kg）麻醉小鼠后，于腹主動脈采集血樣，4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，然后收集血漿置于-80℃冰箱保存。分別利用ELISA試劑盒檢測尿白蛋白，特異性的8-異構前列腺素試劑盒檢測尿8-異構前列腺素，改良的Jaffe肌酐檢測試劑盒測定尿液以及血漿中的肌酐濃度。

1.6 腎臟組織病理學分析

摘取小鼠右腎，稱重后，用4％的多聚甲醛進行固定，石蠟包埋組織切片。采用過碘酸-雪夫反應（PAS）與Masson三色法對4μm厚的組織切片進行染色。為確保實驗結果的客觀性，由一位不知道實驗設計安排的病理學技術人員，根據筆者已經發表的相關方法[6-7]，對染色后的切片進行腎小球硬化程度以及腎小管間質損傷程度的分析評估。依據腎小球產生纖維樣硬化的范圍和腎小管的肥厚、擴張與間質纖維化程度以及炎癥細胞的浸潤程度等來對結果進行半定量分析。

1.7 免疫組織化學染色

F4/80作為單核/巨噬細胞的標記物，本實驗利用卵白素-生物素-酶復合物（ABC）染色法對其進行染色。常規方法處理石蠟包埋的組織切片，然后加入一抗F4/80單克隆抗體（大鼠抗小鼠），于4℃孵育12 h，清洗切片后，加入生物素化二抗即抗大鼠IgG（稀釋比例為1∶400），于室溫孵育1 h，然后加入ABC復合物，繼續于室溫下孵育45 min，最后添加二氨基聯苯胺（DAB）顯色液顯色，于顯微鏡下觀察染色結果。采用加入正常大鼠血清或者不加一抗的方法作為本實驗的陰性對照。依據相關文獻[8]，于×400倍鏡下對F4/80呈陽性細胞的數量進行統計，每張切片隨機觀察15個視野，最后取其平均值來表示單核/巨噬細胞的數目。

1.8 腎組織線粒體ROS測定

實驗結束后，收取新鮮腎組織，按說明利用試劑盒進行線粒體分離，并通過Bradford法進行蛋白定量。然后，將分離獲得的線粒體重新懸浮于HEPES緩沖液（10mmol/L HEPES，140 mmol/L氯化鈉NaCl，5 mmol/L氯化鉀KCl，1.2 mmol/L磷酸一氫鈉Na2HPO4，5 mmol/L碳酸氫鈉NaHCO3，6 mmol/L葡萄糖，1 mmol/L氯化鎂MgCl2，2 mmol/L氯化鈣CaCl2，pH 7.4）中，取10μl樣本溶液加入96孔培養板中，同時加入2'-，7'-dichlorfluoresceindiacetate（DCFHDA，最終濃度為10μmol/L），然后在37℃條件下避光孵育30 min，最后，通過多功能酶標儀于激發波長485 nm和吸收波長520 nm的條件下，進行熒光強度的測定。數據以每毫克蛋白所具有的熒光強度表示。

1.9 統計學方法

采用Prism 5.0統計軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示。本實驗各組小鼠血壓間的比較用兩因素方差分析法（Two-way ANOVA，Bonferroni檢驗）。除血壓外，其他指標多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA，Bonferroni檢驗）。所有分析均用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血壓的變化

如圖1所示，手術前各組小鼠間的基礎血壓差異無統計學意義。手術后各周，對照組小鼠的血壓平穩，沒有出現明顯改變。然而，AngⅡ組和AngⅡ+ mitoTEMPO組小鼠于手術后第1周開始較對照組小鼠血壓升高，差異有統計學意義（130±9）mmHg vs（103±6）mmHg，（t=7.136，P=0.011）；（137±7）mmHg vs（103±6）mmHg，（t=8.987，P=0.009），且到手術后3、4周時達到高峰，但是，AngⅡ組和AngⅡ+mito TEMPO組小鼠血壓之間差異無統計學意義[術后4周：（156±9）mmHg vs（150±11）mmHg，t=1.535，P=0.726]。

圖1 各組小鼠血壓比較

2.2 各組小鼠尿白蛋白、8-異構前列腺素排泄量及肌酐清除率的變化

如圖2所示，與對照組比較，AngⅡ組小鼠24 h尿白蛋白排泄量[（4.19±2.01）μg/24 h vs（54.63± 8.39）μg/24 h，t=12.970，P=0.006]，以及尿8-異構前列腺素的排泄量均增加[（0.3±0.09）ng/24 h vs（2.59±0.31）ng/24 h，t=6.455，P=0.012]，但肌酐清除率表現出下降的現象[（352.10±51.21）ml/24 h vs（102.90±26.45）ml/24 h，t=10.900，P=0.007]。特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO能夠抑制AngⅡ所誘發的上述變化，其差異有統計學意義。尿白蛋白排泄量：[（54.63±8.39）μg/24 h vs（26.06± 9.19）μg/24 h，t=7.347，P=0.011]；肌酐清除率：[（102.90±26.45）ml/24 h vs（210.30±46.60）ml/24 h，t=4.697，P=0.017]；尿8-異構前列腺素的排泄量：[（2.59±0.31）ng/24h vs（1.17±0.29）ng/24 h，t=4.015，P=0.020]。

2.3 各組小鼠腎臟組織病理學的變化

如圖3所示，AngⅡ組小鼠腎臟中腎小球出現纖維樣硬化現象，與對照組比較，其纖維樣硬化指數增高（0.08±0.06 vs 1.78±0.30，t=5.748，P=0.013），而經過mitoTEMPO處理后，纖維樣硬化現象受到抑制，從而減輕AngⅡ誘發的腎小球纖維化（1.78±0.30 vs 0.72±0.20，t=3.584，P=0.022）。另外，如圖4所示，與對照組比較，AngⅡ組小鼠出現明顯的腎小管間質纖維化、炎癥細胞的侵潤以及腎小管的肥厚與擴張等現象，腎小管的間質損傷程度增高（0.18± 0.06 vs 3.20±0.37，t=8.169，P=0.009）。而經過mitoTEMPO處理后，上述變化受到抑制，從而減輕AngⅡ誘導的腎小管間質損傷現象（3.20±0.37 vs 1.46±0.25，t=4.707，P=0.021）。

圖2 各組小鼠尿白蛋白排泄量（A）、肌酐清除率（B）及尿8-異構前列腺素排泄量（C）的變化

圖3 各組小鼠腎臟腎小球硬化程度

圖4 各組小鼠腎臟腎小管間質損害程度

2.4 各組小鼠腎臟免疫組織化學染色的變化

如圖5所示，與對照組比較，在AngⅡ組小鼠的腎臟中F4/80呈陽性的單核/巨噬細胞數量增加[（7.80±2.29）個/mm2vs（68.80±10.34）個/mm2，t= 6.391，P=0.012]，說明以單核/巨噬細胞的浸潤為主要特征的腎臟炎癥反應加重，而經過mitoTEMPO處理后，上述病理變化受到抑制，從而減輕和緩解AngⅡ所誘發的腎臟炎癥反應[（68.80±10.34）個/mm2vs（29.40±4.95）個/mm2，t=4.128，P=0.023]。

2.5 各組小鼠腎臟線粒體介導所產生ROS的變化

如圖6所示，與對照組比較，在AngⅡ組小鼠腎臟，線粒體介導所產生的ROS增加[（20.67±4.76）灰度/mg蛋白vs（55.83±9.45）灰度/mg蛋白，t= 8.350，P=0.009]，mitoTEMPO處理抑制該病理變化，從而阻止在AngⅡ刺激下線粒體介導產生ROS [（55.83±9.45）灰度/mg蛋白vs（26.00±6.89）灰度/mg蛋白，t=7.084，P=0.011]。

圖5 各組小鼠腎臟F4/80呈陽性的單核/巨噬細胞的數量比較

圖6 各組小鼠腎臟線粒體介導所產生活性氧的變化

3 討論

本實驗研究結果表明，通過皮下注射AngⅡ誘發的高血壓能夠造成腎臟功能及病理學損傷，而該損傷主要表現在8-異構前列腺素與尿白蛋白排泄量的增加、肌酐清除率的下降、腎組織線粒體ROS產生的增多，以及包括腎小管肥厚、擴張在內的腎小管間質損傷與腎小球硬化等方面。而由AngⅡ誘發的上述所有腎臟損害均被特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO抑制，該研究結果表明線粒體介導產生的ROS能夠促進AngⅡ所誘發的腎臟損害。

造成腎臟功能損傷的機制之一是由于高血壓發生及發展過程中的血壓升高[9]。通過對小鼠尾動脈收縮壓的測定分析結果說明在小鼠中通過皮下注射AngⅡ可誘發高血壓，而特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO可以緩解和抑制高血壓誘發的腎臟損害，然而，線粒體ROS清除劑mitoTEMPO并不影響皮下注射AngⅡ誘發的高血壓。因此，筆者推測，在由高血壓引起的腎臟損傷過程中，特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO介導的腎臟保護作用，主要是通過mitoTEMPO對線粒體所產生ROS的清除作用而不是對血壓的影響作用。本實驗結果表明在皮下注射AngⅡ誘發的高血壓過程中，線粒體ROS清除劑mitoTEMPO表現出的腎臟保護作用并不是通過降低血壓來實現的。

在正常生理狀態下，線粒體的主要功能為通過氧化磷酸化產生能量，從而參與細胞的能量代謝，同時線粒體還參與對氧自由基和鈣離子介導的信息傳遞，以及對細胞衰老的調控作用，其中包括對細胞凋亡的調節作用[3，10]。當線粒體功能下降時，通常表現為ROS增多，從而造成組織器官的損害。因此，在病理狀態下，除NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶和非耦聯的一氧化氮合成酶外，線粒體是ROS的重要來源，并且大量研究證實mitoTEMPO是特異性的線粒體產生的ROS清除劑[11-12]。近年來，除線粒體外，其他ROS產生酶即NADPH氧化酶和非耦聯的一氧化氮合成酶在促進高血壓及其并發癥的發生和發展中的作用受到了廣泛深入的研究[13]。目前，隨著對高血壓發病機制研究的進展，有關線粒體功能及其所產生的ROS在該疾病中的作用逐漸受到人們的關注和研究。

目前，人們還沒有完全明確由高血壓而引起的腎臟功能損傷的具體機制。但是，已有相關報道證實氧化應激反應在該過程中發揮促進作用[4-5]。在病理狀態下，大量的ROS可氧化包括細胞膜和DNA在內的多種細胞成分，從而造成機體組織器官的損傷。8-異構前列腺素作為氧化應激產物之一，目前通常被用來作為測定對象來確定氧化應激程度，以測定結果來反映組織器官內ROS的水平。本實驗結果表明，通過皮下注射AngⅡ誘發腎臟損害時，尿8-異構前列腺素的排泄量增加，從而間接反映出腎臟內氧自由基水平的增高。另外，筆者進一步發現和證實在AngⅡ誘發的高血壓過程中，腎臟組織內線粒體介導產生的ROS增加。然而，經過特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO處理后，AngⅡ導致的腎臟損害受到抑制。因此，根據本實驗的研究結果，在AngⅡ誘發的高血壓過程中，線粒體介導產生的ROS對其誘導的腎臟損害具有促進作用。

本研究證實AngⅡ可以誘發腎臟損害，而在此過程中線粒體介導產生的ROS發揮著非常重要的作用。在AngⅡ所致高血壓過程中，特異性的線粒體ROS清除劑mitoTEMPO通過抑制線粒體產生的氧自由基及其所介導的組織器官損害而實現其腎臟保護的作用。因此，在臨床中，通過一些藥理學方法改善線粒體功能，從而減少線粒體ROS的產生，或許可以作為防治高血壓，以及由高血壓造成的腎臟損傷的途徑之一。

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（張蕾 編輯）

Role of mitochondrial reactive oxygen species in angiotensinⅡ-induced renal injury*

Miao-miao Feng1,Su-xiao Liu2,Xiao-xiao Wang2,Lin Cui2,Shi-yang Xie2, Si Shen2,Ming-jun Zhu2,You-ping Wang2
(1.Clinical Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450008,China;2.The First Affiliated Hospital, Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450000,China)

ObjectiveTo clarify the role of mitochondrial reactive oxygen species(ROS)in angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced renal injury by use of a specific scavenger of mitochondrial ROS,mitoTEMPO.MethodsThe mouse model of AngⅡ-dependent hypertension was induced with infusion of AngⅡvia subcutaneous miniosmotic pump, and the sham mice were given with normal saline.The AngⅡ-dependent hypertensive mice were divided into control(AngⅡ)group and experimental(AngⅡ+mitoTEMPO)group,which were subcutaneously administered with solvent and mitoTEMPO,respectively.Tail-cuff systolic blood pressure,and urinary excretion of 8-isoprostane and albumin,creatinine clearance,and the levels of mitochondrial ROS in the kidneys were assayed,and pathological changes of renal tissues were analyzed after 4 weeks of treatment.ResultsCompared with the shammice,AngⅡinfusion led to increased systolic blood pressure and urinary excretion of 8-isoprostane and albumin, decreased creatinine clearance,and enhanced glomerulosclerosis index and renal tubulointerstitial injury(P＜0.05). The results were accompanied by the enhanced mitochondrial ROS production in the kidneys(P＜0.05).However,the treatment with mitoTEMPO alleviated all the above changes except for blood pressure,leading to renal protection(P＜0.05).ConclusionsTreatment with a specific scavenger of mitochondrial ROS,mitoTEMPO,can inhibit renal injury during AngⅡ-dependent hypertension,which is associated with the decreased mitochondrial ROS production in the kidneys.Thus,the results suggest that mitochondrial ROS can promote AngⅡ-induced renal injury.

angiotensin II;hypertension;renal injury;mitochondria;reactive oxygen species

R544.1

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.002

1005-8982（2017）02-0013-06

2016-06-08

國家自然科學基金（No：81170243）；河南省科技創新杰出人才項目（No：124200510007）；河南省科技攻關計劃項目（No：162102410048）

王幼平，Tel：0371-66248345；E-mail：wangyp8@163.com