IL-7R在膝關節骨關節炎滑膜中的表達及意義

趙清，王婧，王來芳

（河南大學淮河醫院，風濕免疫科，河南開封475000）

臨床論著

IL-7R在膝關節骨關節炎滑膜中的表達及意義

趙清，王婧，王來芳

（河南大學淮河醫院，風濕免疫科，河南開封475000）

目的探討白細胞介素7受體（IL-7R）基因在膝關節骨關節炎（KOA）疾病中的表達作用及意義，為其診斷和治療以及進一步研究提供一定的科學依據。方法選取河南大學淮河醫院骨科70例患者新鮮滑膜組織，采用Trizol法提取總RNA，采取Applied Biosystems逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA第一鏈，用實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real time RT-PCR）檢測膝關節髕上囊滑膜組織中IL-7R基因的表達。結果IL-7R基因表達在KOA滑膜組織中降低（P＜0.05）。結論IL-7R在KOA滑膜中的表達下降，且與膝關節骨關節炎病變有密切的關聯，為檢測和治療KOA疾病提供一定數據支撐和參考。

骨關節炎；白細胞介素7受體；基因；滑膜組織

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種漸進性喪失功能的骨科常見退行性疾病[1]。它是一種嚴重危害中老年人健康的慢性骨關節疾病，表現為關節疼痛、關節僵硬、失去活動靈活性或致殘[2]。在臨床上最為常見的是膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA），且其發病率很高，是一組有著不同病因卻有著相似的生物學、形態學和臨床表現的疾病[3]。目前，對于KOA的治療方法主要是早期采用藥物治療來保護患者和延緩病變，或利用玻璃酸鈉聯合復方倍他米松注射于關節腔內，對KOA有顯著療效且無明顯的不良反應[4]。而對于嚴重的晚期患者，就要采用手術治療方法，研究表明，KOA發生、發展的過程與多種細胞因子和生長因子有關，如白細胞介素1家族、轉移生長因子和炎癥因子等[5]。其中炎癥因子大部分為炎性滑膜組織分泌，白細胞介素7受體（interleukin-7 receptor，IL-7R）就是該過程中最重要的炎癥因子之一。在淋巴細胞增殖和分化過程中IL-7R是必不可缺少的因子，而導致B系淋巴細胞和T系淋巴細胞生成的障礙主要是其在細胞表面的缺失[6]，造成重癥聯合免疫缺陷病主要是IL-7Rα或c缺陷引起的T細胞缺乏。最新研究表明，阻斷IL-7R可以治療類風濕性關節炎[7-8]。本實驗旨在運用實時逆轉錄集合酶鏈反應（real time RT-PCR）方法檢測IL-7R基因在KOA滑膜中的表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

OA組：取膝關節骨關節炎行膝關節人工關節置換術患者40例，平均年齡為（65.66±1.34）歲的膝關節髕上囊滑膜組織。對照組：取在關節鏡下交叉韌帶損傷和半月板損傷患者30例，平均年齡為（21.78± 2.58）歲的膝關節髕上囊滑膜組織。

取下的膝關節髕上囊滑膜組織離體后，直接置于含有液氮的無菌管中，30 min后放入-80℃的冰箱中保存備用。

1.2 診斷標準

KOA患者均符合放射線Kellgren-Lawrence分級診斷標準的Ⅲ、Ⅳ級（見表1）。

1.3 實驗試劑

Trizol Reagent（Invitrogen公司），M-MLV Reverse Transcriptase（Invitrogen公司），SuperscriptⅢRT（Invitrogen公司），RNase out（Invitrogen公司），Primers：9N Random Primer及PCR Primers（Invitrogen公司），5×First-Strand Buffer（Pro Mab公司），2×Loading Buffer（Pro Mab公司），Recombinant Rnasin R RNase Inhibitor（Promega公司），dNTP Mixture（TaKaRa公司），2 000 bp DNA maker（TaKaRa公司），Ex Taq酶（Fermentas公司），0.1 mol DTT（碧云天生物技術研究所），Power SYBR R Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司）。

表1 Kellgren-Lawrence分級診斷標準

1.4 實驗儀器

Real time RT-PCR儀7500型（Applied Biosystems公司），電泳儀及電源、附件（BIO-RAD公司），全自動菌落及化學發光凝膠成像系統（UVP公司），低溫度高速離心機（SIGMA公司），超低溫冰箱（-80℃）（Forma Scientific公司），低溫冰箱（-20℃）（海爾電器有限公司），各種無酶吸頭（Axygen公司），各種無酶EP管（Axygen公司），Tube管（Axygen公司），研磨器（Roche公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 RNA的提取（Trizol法）取約100 mg新鮮冷凍膝關節髕上囊滑膜組織，將其研成粉末，充分揮發液氮，加入1 ml Trizol Reagent，混勻，室溫下靜置10 min。再加入200 μl氯仿，劇烈震蕩混勻，靜置8 min，分層。在4℃的條件下離心15min（15000r/min）。吸取上層水液400 ml，移至1.5 ml Tube管中。再加入等體積異丙醇溶液，混勻，室溫下靜置8 min。再在4℃的條件下離心15 min（15 000 r/min）。棄去上清液，加入經DEPC處理的75％冷乙醇，斡旋震蕩，使沉淀漂浮，4℃離心5 min（15 000 r/min），再棄去上清液，干燥。在20μl的Tube管中用ddH2O溶解RNA。取2μl RNA，用ddH2O稀釋100倍，即得。

1.5.2 cDNA第一鏈的合成取2μg RNA置于反應管中，加入Oligo dT 1μl，再加入2.5 mmol dNTP mix 4μl，混勻，加ddH2O至13μl。在60℃條件下靜置10 min后，放在冰上放置1min以上。再在反應管中加入5×First-Strand Buffer 4μl，0.1 mmol DDT 1μl，RNase out（40 u/μl）1μl，SuperscriptⅢRT 1μl，震蕩混勻后離心，在70℃條件下通過滅活逆轉錄酶，合成cDNA第一鏈，在4℃條件下保存。

1.5.3 RNA逆轉錄逆轉錄反應體系和反應程序見表2。逆轉錄終止反應程序：在70℃條件下加入1.5 mol NaOH 5μl終止逆轉錄反應，10 min后，加入10mol/L乙酸1μl中和，再加入Nuclease-Free Water至50μl，在4℃可以短期低溫保存，置入-80℃冰箱長期低溫保存。

1.5.4 逆轉錄終止反應程序在70℃條件下加入1.5 mol氫氧化鈉5μl終止逆轉錄反應，10 min后，加入10 mol/L乙酸1μl中和，再加入Nuclease-Free Water至50μl，在4℃可以短期低溫保存，置入-80℃冰箱長期低溫保存。

實時定量PCR反應體系見表3。實時定量PCR程序見表4。

1.5.5 實時定量PCR產物1.5％非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測見表5。1.5％非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測條件：120 V，15～20 min。1.5％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測條件：120～130 V，15～20 min。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，本實驗按照隨機、對照、均衡及重復的分組設計原則，對其行多組間t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表2 實時定量RT-PCR逆轉錄反應體系及反應程序

表3 實時定量PCR反應體系

表4 實時定量PCR反應程序

表5 實時定量PCR產物1.5％非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測

2 結果

2.1 組織總RNA電泳鑒定

1.5 ％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結果中可以看出，real time RT-PCR反應的特異性都非常好。見圖1。

2.2 Real time RT-PCR分析

實驗結果表明，KOA患者膝關節髕上囊滑膜組織較正常滑膜組織中IL-7R基因表達降低。見圖2。

2.3 IL-7R mRNA統計學分析

IL-7R mRNA統計學分析見表6。

統計結果表明，膝關節骨關節炎滑膜組織中IL-7R的表達量低于正常膝關節滑膜組織的表達。

圖1 電泳結果

圖2 骨關節炎膝關節滑膜組織與正常滑膜組織對IL-7R mRNA的表達

表6 人膝關節骨關節炎滑膜組織與正常滑膜組織對IL-7R mRNA的相對表達量（±s）

項目P值2-△△Ct0.15±0.640.90±0.120.001骨關節炎滑膜組織正常滑膜組織

3 討論

目前，國內對于運用白細胞介素7受體診斷和治療膝關節骨關節炎的研究并不多，故本文研究IL-7R基因與KOA患者的關系。通過RT-PCR的方法對KOA患者和正常的膝關節滑膜組織進行比較，結果發現IL-7R基因在膝關節骨關節炎滑膜組織中的表達明顯降低。

骨關節炎是一種與年齡有密切關系的骨科普遍疾病，隨著世界老齡化人口的增多，膝關節骨關節炎患者的發病率也有逐年增長的趨勢，嚴重地影響老年人的正常生活以及生活質量。骨關節炎最終病理變化的主要特征是關節軟骨的變性和破壞，主要是由于軟骨合成與降解平衡的失調所造成的[9-10]。而骨關節炎的主要特征是軟骨下骨的硬化和骨贅的形成[11]。在該過程中是滑膜炎癥的影響和參與導致軟骨的結構變化。現今治療膝關節骨關節炎還未有比較合適的方法，而目前的基因治療骨關節炎正在逐漸成為研究的熱點[12]。近幾年研究表明，細胞因子與KOA的形成及發展有著十分密切的關系，其中的白細胞介素與白細胞介素受體就起著至關重要的作用[13]。

白細胞介素7受體是由一條特異性配體結合α鏈（IL-7Rα）與一條公用鏈（c）結合而成的[14]。研究表明，類風濕性關節炎患者滑膜組織中的IL-7R α，比KOA患者表達更高，其表達且與白細胞介素7的表達有著密不可分的關系[15-16]。白細胞介素7受體信號途徑可以影響軟骨細胞，軟骨細胞分泌白細胞介素7，且也可以表達白細胞介素7受體，并能夠接受白細胞介素7傳播的刺激信號，且可以分泌能夠降解軟骨中蛋白聚糖的基質金屬蛋白酶13和蛋白多糖，故可以通過阻斷白細胞介素7受體的方法，來防止軟骨的降解及骨質的損壞[17]。

本研究結果表明，膝關節骨關節炎滑膜組織比正常的滑膜組織有明顯的基因表達差異。在KOA患者的膝關節滑膜中形成的IL-7R在KOA的病理過程中起到重要的作用，而其也有可能是造成膝關節滑膜炎癥持續化及慢性化的主要原因。在今后的診斷和治療中可以把IL-7R作為一個靶點，為臨床上治療膝關節骨關節炎提供一個新的方法。

[1]FORESTIER R,FRANCON A,BRIOLE V,et al.Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis[J]. Joint Bone Spine,2011,78(3):275-278.

[2]VASHEGHANI F,MONEMDJOU R,FAHMI H,et al.Adult cartilage-specific peroxisome proliferator-activated receptor gamma knockout mice exhibit the spontaneous osteoarthritis phenotype[J]. Am J Pathol,2013,182(4):1099-1106.

[3]MIYAZAKI T,WADA M,KAWAHARA H,et al.Dynamic load at baseline can predict radiographic disease progression in medial compartment knee osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis,2002,61(7): 617-622.

[4]楊貴生,吳吉元.玻璃酸鈉聯合復方倍他米松對膝骨關節炎的療效觀察[J].中國生化藥物雜志,2012,33(4):465-466.

[5]帥明.白細胞介素-1β、HIF-1α和VEGF在兔骨性關節炎模型的滑膜中的表達[D].廣州:南方醫科大學,2010.

[6]FEWKES N M,MACKALL C L.IL-7 in human health and disease[J].Seminars in immunology,2012,24(3):218-224.

[7]王阮霞,聶紅.白細胞介素-7/白細胞介素-7R受體信號途徑與類風濕關節炎治療的研究進展[J].中華風濕病學雜志,2012,16(2): 135-138.

[8]張敏.HE染色在臨床病理診斷中的應用[J].齊齊哈爾醫學院學報, 2011,4(4):35-38.

[9]PAUL C.Where dose it hurt?Pain localization in osteoarthritis of the knee[J].Osteoarthritis and Cartilage,1999,6(5):178-183.

[10]丁鵬,劉永哲.白細胞介素-7的生物學特性及其在臨床治療中的作用和意義[J].中國醫學前沿雜志,2011,3(4):116-120.

[11]LOESER R F.Age-related changes in the musculoskeletal system and the development of osteoarthritis[J].Clin Geriatr Med, 2010,26:371-386.

[12]耿青青,郝逸明.骨髓中IL-7、IL-7R及EBF表達與運動性免疫抑制[J].體育學刊,2011,18(1):169-172.

[13]LEE H C.Transcriptional regulation of the mouse IL-7 receptor a promoter by glucocorticoid receptor[J].Osteoarthritis and Cartilage,2005,13(2):268-271.

[14]HARTGRING S A,VAN ROON J A.Elevated expression of interleukin-7 receptor in inflamed joints mediates interleukin-7-induced immune activation in rheumatoidarthritis[J].Arthritis Rheum,2009,60(3):2595-2650.

[15]朱繼峰.IL-7抑制巨噬細胞調亡的機制研究[J].病原生物學, 2012,10(2):156-159.

[16]巨春蓉.Smad7在大鼠肺間質纖維化中的表達及白介素-7的治療作用[J].國際呼吸雜志,2006,26(7):486-489.

[17]王慧,周佩軍.白細胞介素-7及其受體的生理功能與免疫重建[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2007,16(4):349-353.

（張西倩 編輯）

Expression and significance ofIL-7Rgene in synovium of osteoarthritic knee

Qing Zhao,Jing Wang,Lai-fang Wang
(Department of Immunology,Huaihe Hospital of Henan University,Kaifeng, Henan 475000,China)

ObjectiveTo discuss expression of knee joint synovialIL-7Rgenes in knee osteoarthritis(KOA)and the significance so as to provide scientific basis for diagnosis,treatment and research of knee osteoarthritis.MethodsFresh synovial tissue was collected from 70 orthopedic patients in a hospital.Trizol method was used to extract total RNA in the synovial tissue.The Applied Biosystems retrovirus kit was used to synthesize the first chain of cDNA through reverse transcription.The expression ofIL-7Rgene in osteoarthritic knee synovium was detected by RT-PCR.ResultsIL-7Rgene expression in osteoarthritic knee synovial tissue obviously decreased(P＜0.01).ConclusionsIL-7Rexpression in the osteoarthritic knee synovial tissue obviously decreases and is positively correlated with the progression of KOA.Therefore,it provides available information for the detection and treatment of KOA.

osteoarthritis;IL-7R;gene;synovial tissue

R684.3

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.009

1005-8982（2017）02-0052-04

2016-07-09