自組裝管尖固相萃取/超高效液相色譜-高分辨質譜法測定水果中的15種酸性農藥

邱楠楠，董桂賢，陳達煒*，周 爽，趙云峰

(1.國家食品安全風險評估中心/衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021；2.煙臺市疾病預防控制中心，山東 煙臺 264003)

自組裝管尖固相萃取/超高效液相色譜-高分辨質譜法測定水果中的15種酸性農藥

邱楠楠1，董桂賢2，陳達煒1*，周 爽1，趙云峰1

(1.國家食品安全風險評估中心/衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021；2.煙臺市疾病預防控制中心，山東 煙臺 264003)

建立自組裝管尖固相萃取結合超高效液相色譜-高分辨質譜檢測水果中15種酸性農藥殘留的分析方法。水果樣品經甲酸-乙腈(1∶99，體積比)提取后，以官能化聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)和親水作用色譜(HILIC)作為吸附填料進行管尖固相萃取凈化。以T3色譜柱進行色譜分離，采用高分辨質譜的tSIM/ddMS2掃描模式進行定性、定量分析，內標法測定。15種酸性農藥在各自線性范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.99。方法的定量下限(LOQ)為0.2～10 μg/kg。在LOQ,10 μg/kg，100 μg/kg加標水平下，15種酸性農藥的回收率為73.5%～115.9%，相對標準偏差為1.0%～8.3%。該方法靈敏、準確，適用于水果中酸性農藥殘留的分析測定，具有很好的實際應用價值。

管尖固相萃取；超高效液相色譜-高分辨質譜法；水果；酸性農藥

隨著化學工業的發展，除草劑的品種日漸增多，在全球農藥的銷售中除草劑約占市場一半份額。酸性農藥作為除草劑中的重要種類之一，被用作植物小麥、玉米等除草劑和植物生長的調節劑，可以防止植物落花落果，誘導無籽果實形成，在世界各國的農業生產中被廣泛使用。近些年，酸性農藥作為果實保鮮劑應用于水果中[1]。研究表明，許多酸性農藥本身具有中等毒性，可以引起人類軟組織惡性腫瘤,如2,4-滴具有Ⅰ等毒性，可能與非霍奇金淋巴瘤的發生有關[2-3]；同時，酸性農藥及其代謝產物能夠長時間存在于被噴灑的雜草和有害植物中，對人類和動物產生毒性危害，動物體甚至能夠表現出胎盤毒性[4]。鑒于酸性農藥的潛在危害性，為了保障人們的食用安全，許多國家都針對這些農藥制定了最高殘留限量標準(MRLs)，項目逐漸增多，限量標準日漸嚴格，因此對酸性農藥殘留的檢測分析方法研究也日益迫切。

目前，國內外報道的酸性農藥殘留檢測方法主要采用氣相色譜-質譜法(GC-MS)[5-7]、高效液相色譜法(LC)和高效液相色譜-質譜法(LC-MS)[8-9]，研究的基質包括地表水、蔬菜、糧谷、茶葉以及水果。酸性農藥因含有羧基或羥基等極性基團，部分化合物的極性較大、沸點較高、難以氣化，因此采用GC-MS不能直接測定，需經柱前衍生的方式，操作較為繁瑣；而LC-MS則較適用于此類型化合物的檢測分析。當前的前處理方法通常包括固相萃取柱(SPE)和分散固相萃取(DSPE)[10-13]。常規的SPE凈化步驟繁瑣，操作復雜，常需額外的預濃縮，導致回收率不理想；采用DSPE凈化，雖然無需對分析液進行濃縮，但去除基質干擾的能力有限。基于現有SPE和DSPE凈化技術的優缺點，本研究組開發了一種自組裝的管尖固相萃取技術(Pipette tip solid-phase extraction,PTSPE)，其具有操作簡單，無需離心、氮吹等操作，且凈化效果好等特點[14]。本實驗以水果為研究對象，采用PTSPE凈化，首次以官能化聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)和親水作用色譜(HILIC)作為吸附填料，結合超高效液相色譜-高分辨質譜(UPLC-HRMS)建立了水果中15種酸性農藥的檢測方法。本方法快速、簡單、靈敏、可靠，能夠滿足國內外標準的檢測要求，適用于對水果中酸性農藥殘留的定性定量分析，已應用于實際樣品的分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜系統(Q Exactive)及Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜系統(美國Thermo公司)；渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；Sigma 3K15高速離心機(美國Sigma公司)；乙腈(色譜純，Fisher Scientific公司)，甲酸(HPLC級，Tedia公司)；氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純，國藥試劑有限公司)；酸性農藥標準品及2,4-D-13C6同位素內標(純度>98%，德國DR.Ehrenstorfer公司)；實驗用水為二次蒸餾水。PEP和HILIC粉購自天津博納艾杰爾公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取各酸性農藥標準品10 mg(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成1 000 mg/L的標準儲備溶液，冷凍(-18 ℃以下)貯存。用50%乙腈稀釋標準儲備溶液，配制成各濃度的混合標準工作液，冷藏(約4 ℃)貯存。

1.3 自組裝的PTSPE

圖1 自組裝管尖固相萃取示意圖Fig.1 Self-assembly pipette tip solid-phase extraction procedure

PTSPE作為一種小型化的SPE模式，具有操作簡單、快捷、填料用量少等特點，被廣泛應用于生物樣品的痕量檢測分析[14-16]。本實驗開發的自組裝PTSPE裝置如圖1所示，主要由兩根移液槍頭(200 μL和1 mL)和accu-jet?電動控制移液器組成。首先，用脫脂棉堵住200 μL槍頭底部，將吸附填料裝入至槍頭中，上端再用脫脂棉封口；然后上接1 mL槍頭，將其套入電動控制移液器中，通過電動控制移液器進行樣品上下循環的吸液、放液以完成樣品凈化。

1.4 樣品處理

1.4.1 提 取取水果樣品10 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，添加1 mg/L 2,4-D-13C6內標溶液100 μL，渦旋混勻后加入10 mL的甲酸-乙腈溶液(1∶99)，渦旋提取5 min，加入2 g氯化鈉和8 g無水硫酸鈉，渦旋30 s后，以5 000 r/min離心5 min。取上清液，待凈化。

1.4.2 PTSPE凈化取上清液0.5 mL進行PTSPE凈化，PTSPE柱中填有20 mg PEP和20 mg HILIC填料，通過5次上下吸液、放液循環吸附凈化后，取0.4 mL凈化液，加入0.4 mL水，混勻過0.22 μm有機相濾膜，注入UPLC-HRMS分析測定。

1.5 色譜與質譜條件

UPLC色譜條件：流動相A為含0.05‰甲酸的水溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～2 min，5%B；2～10 min，5%～90%B；10～11.5 min，90%～100%B；11.5～15 min，100%～5%B；15～16 min，5%B。進樣量：5 μL；流速:300 μL/min；柱溫：40 ℃；Waters Acquity UPLC BEH T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進行分離。

質譜條件:采用HESI 離子化方式；噴霧電壓3.5 kV；毛細管溫度325 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣40 arb，輔助氣10 arb；掃描模式為tSIM/ddMS2，正、負離子采集模式；tSIM采集采用70 000 FWHM分辨率，Maximum IT為100 ms，MSX為4，Isolation window為4m/z；ddMS2采集分辨率為17 500 FWHM，Loop Count為1，TopN設為5，碰撞裂解能量(NCE)為35 eV。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

采用BEH T3色譜分析柱，比較了純水、含0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸銨的水溶液、含0.1%甲酸的水溶液和含0.05‰甲酸的水溶液作為流動相A，以及甲醇、乙腈和含0.1%甲酸的乙腈溶液作為流動相B的效果。結果表明，流動相采用乙腈-水的分析時間比甲醇-水的分析時間更短，并且能夠提高一些保留時間較為相近的酸性農藥的分離度，因此選用乙腈-水作為分離體系。以該體系為流動相分離時，氯氨吡啶酸、二氯吡啶酸和毒莠定的出峰時間過早，可能是由于在純水流動相中，這些酸性農藥形成內鹽，造成這3種化合物在色譜柱的保留較差；而在流動相中添加0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸銨后，部分化合物不出峰或響應下降，主要是酸性介質抑制了這些化合物的負離子采集。而以含0.05‰甲酸的水溶液和乙腈溶液為流動相分離時，15種酸性農藥均出峰，并保持較好的響應以及色譜分離，因此，本實驗以此流動相體系作為15種酸性農藥的色譜分離條件(圖2)。

2.2 高分辨質譜的篩查分析

Full Scan和tSIM是高分辨質譜Q Orbitrap最為常用的兩種定量篩查模式，其均以精確母離子進行定量，無需繁瑣的參數優化過程。前期工作中，本研究組發現由于tSIM采集模式具有更窄的監測掃描范圍，從而較Full Scan模式具有更好的信號響應[17]。本實驗采用tSIM/ddMS2掃描模式，先通過目標化合物的精確母離子進行tSIM采集，以此采集響應信號進行定量分析；同時tSIM采集后觸發該母離子下的二級質譜ddMS2采集，獲得目標物的二級質譜圖，進而以二級質譜碎片進行定性確證。以氯氨吡啶酸為例，圖3A為tSIM采集所獲得的母離子m/z206.972 2[M+H]+下的離子色譜圖；圖3B為觸發該母離子ddMS2采集下的二級質譜圖譜，以精確的二級質譜碎片m/z178.976 6和149.022 7進行定性確證。15種酸性農藥的母離子和二級質譜碎片信息見表1。

2.3 凈化方法的選擇及優化

本實驗采用PTSPE程序完成樣品的凈化，與DSPE凈化相比，其具有更好的凈化效果，主要是由于DSPE凈化屬于一次性分散型凈化，而PTSPE凈化屬于小型化SPE柱，同時借助于電動控制移液器可進行樣品上下式循環的凈化，充分發揮PTSPE的凈化效果。此外，吸附填料的選擇是保證PTSPE凈化效果的關鍵。在常規DSPE凈化中，PSA，C18和GCB是3種最為常用的分散型吸附填料。由于15種酸性農藥含有芳香官能基團和酸性官能團，這決定了PSA和GCB填料會對酸性農藥產生明顯的吸附，從而影響目標物的回收率。目前，現有文獻基本采用C18為吸附填料用于DSPE凈化，但凈化效果受到一定影響，導致目標物仍存在一定的基質效應[1]。由于水果樣品基質中含有較多的糖、小分子有機酸和氨基酸等極性化合物，本實驗采用親水性的HILIC吸附填料，能夠對極性化合物雜質較好的吸附，并結合聚合型反相填料PEP，從而充分地對水果樣品進行凈化。為了得到較好的凈化效果，采用單因素分析對影響PTSPE過程的主要因素(填料用量、吸附循環次數)進行優化，以目標物在凈化液中的基質效應為評判標準。結果顯示：使用20 mg PEP和20 mg HILIC填料，通過5次吸附循環后，可獲得最佳的凈化效果。

2.4 基質效應

用50%乙腈配制各系列濃度范圍的15種酸性農藥混合標準溶液并繪制標準曲線，同時稱取空白的蘋果、圣女果和草莓樣品，按照“1.4”方法進行提取凈化，用空白樣品液配制系列同濃度的基質混合標準溶液并繪制標準曲線。以基質標準溶液和溶劑標準溶液的標準曲線斜率比值來評價基質效應，比值越接近1.0表示基質效應越弱。結果發現，15種酸性農藥在蘋果、草莓、圣女果3種水果基質中的斜率比值分別為0.91～1.05,0.98～1.20,0.96～1.09，均在0.91～1.20之間；根據Frenich等[18]的研究結果，基質效應在0.8～1.2 之間為存在弱的基質效應，是可以接受的，而超出此范圍則認為存在強的基質效應。然而，部分酸性農藥在草莓樣品中仍存在一定的基質增強效應。為了準確定量不同水果樣品中的酸性農藥，確保定量分析結果的可靠性，本實驗3種水果均以2,4-D-13C6作為內標進行校準定量。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

將15種酸性農藥配制成系列標準溶液，按照“1.5”分析條件，濃度由低到高的順序依次進樣分析，內標法定量，內標濃度為5 μg/L。結果表明，酸性農藥在各自的系列濃度范圍內均呈良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.99(見表1)。分別添加低水平的酸性農藥標準品于空白水果樣品中，按照已建立的方法對含15種酸性農藥的混合標準溶液進行測定和分析，分別以3倍和10倍信噪比對應的加標水平為檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到本方法的LOD為0.1～3.0 μg/kg，LOQ為0.2～10 μg/kg(見表1)。

表1 15種酸性農藥的線性關系、質譜信息、檢出限以及定量下限

Y:peak area ratio of analyte to the internal standard;X:mass concentration of analyte(μg/L)

2.6 準確度與精密度

分別取蘋果、圣女果和草莓樣品進行加標回收試驗，加標水平分別為LOQ，10 μg/kg，100 μg/kg，按照“1.4”方法對3種水果樣品提取凈化后，分析測定，每個濃度水平重復5次，計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表2。在3個加標水平下，酸性農藥在蘋果樣品中的回收率為77.8%～112.8%，RSD為1.0%～8.3%；在圣女果樣品中的回收率為73.5%～111.5%，RSD為1.1%～7.6%；在草莓樣品中的回收率為73.9%～115.9%，RSD為1.2%～6.6%，表明該方法的準確度和精密度良好。

2.7 實際樣品測定

利用本方法對北京市售的10份蘋果、5份圣女果和6份草莓樣品進行15種酸性農藥的殘留檢測，其中3份蘋果樣品檢出2,4-滴，含量為10.7～82.1 μg/kg，2份蘋果樣品檢出MCPA，含量為4.2～12.7 μg/kg，其它樣品均未檢出15種酸性農藥殘留。

表2 空白樣品的加標回收率及相對標準偏差

(續表2)

3 結 論

本研究建立了一套自組裝PTSPE前處理技術應用于水果中15種酸性農藥殘留的凈化，并首次以PEP和HILIC填料作為凈化吸附填料應用于管尖固相萃取技術。該前處理技術操作簡單、快捷、填料用量少，與DSPE技術相比，具有更好的凈化效果。結合高分辨質譜技術，使該方法的靈敏度、準確性和精密度等技術指標均能夠滿足國內外標準的檢測要求，適用于對水果中酸性農藥殘留的定性定量分析，具有很好的實際應用價值。

[1] Jin F,Shi X M,Yu Z Y,Li M J,Shao H,Jin M J,Wang J.Chin.J.Anal.Chem.(金芬，史曉梅，于志勇，李敏潔，邵華，金茂俊，王靜.分析化學),2013,41(3):354-359.

[2] Zahm S H,Weisenburger D D,Babbitt P A,Saal R C,Vaught J B,Cantor K P,Blair A.Epidemiology,1990,1(5):349-356.

[3] Gui J Y,Wei F X,Qi J X,Chen Z Y,Zhang Z J,Zhang L,Zhang Y T,Li X Y,Zuo H Y,Wang H R.Chin.J.Anal.Chem.(桂建業，魏福祥，齊繼祥，陳宗宇，張兆吉，張莉，張永濤，李曉亞，左海英，王浩然.分析化學),2011,39(12):1877-1881.

[4] Li X Y,Gui J Y,Zhang L,Zhang Y T,Li K.RockMiner.Anal.(李曉亞，桂建業，張莉，張永濤，李科.巖礦測試),2011,30(3):349-352.

[5] Yan H F,Huang Z Q,Zhang Y,Li Y J,Wang M L.Chin.J.Chromatogr.(顏鴻飛，黃志強，張瑩，李擁軍，王美玲.色譜),2009,27(3):288-293.

[6] Zhao S C,Dong Z L,Wei F,Jiang J Y,Jiang W F,Xie B.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(趙守成，董振霖，衛鋒，蔣景陽，姜文鳳，謝波.質譜學報),2005,26(4):206-210.

[7] Henriksen T,Svensmark B,Lindhardt B,Juhler R K.Chemosphere,2001,44(7):1531-1539.

[8] Rosales-Conrado N, León-González M E,Pérez-Arribas L V,Polo-Díez L M.Anal.Chim.Acta,2002,470(2):147-154.

[9] Thomas W M,William C B.J.Chromatogr.Sci.,2003,41:343-349.

[10] Chen F,Cai S J,Li Q Y,Liu L Y.Chin.J.Anal.Lab.(陳鋒，蔡少杰，李慶云，劉麗儀.分析試驗室),2008,27(5):286-288.

[11] Wang J,Chow W,Leung D.Anal.Bioanal.Chem.,2010,396:1513-1538．

[12] Wang L Z,Huang X Y,Chen Y,Lin Z X,Wang G F,Zhou Y.J.Instrum.Anal.(王連珠，黃小燕，陳泳，林子旭，王根芳，周昱.分析測試學報),2014,33(10):1102-1108.

[13] Sack C，Smoker M,Chamkasem N,Thompson R,Satterfield G,Masse C,Mercer G,Neuhaus B,Cassias I,Chang E,Lin Y,Macmahon S,Wong J,Zhang K,Smith R E.J.Agric.FoodChem.,2011,59:6383-6411．

[14] Zhang Y P,Chen D W,Hong Z.Toxins,2016,8(10):1-13.

[15] Shen Q,Dong W,Wang Y X,Gong L K,Dai Z Y,Cheung H Y.J.Pharm.Biomed.Anal.,2013,80:136-140.

[16] Yuan Y N,Liang S R,Yan H Y,Ma Z Y,Liu Y X.J.Chromatogr.A,2015,1408:49-55.

[17] Chen D W,Zhao Y F,Miao H,Wu Y N.Talanta,2015,134:144-152.

[18] Frenich A G,Romero-González R,Gómez-Pérez M L,Vidal J L M.J.Chromatogr.A,2011,1218:4349-4356.

Determination of 15 Acidic Pesticides in Fruit by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry with a Self-assembly Pipette Tip Solid-phase Extraction

QIU Nan-nan1,DONG Gui-xian2,CHEN Da-wei1*,ZHOU Shuang1,ZHAO Yun-feng1

(1.China National Centre for Food Safety Risk Assessment/Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment,Ministry of Health,Beijing 100021，China；2.Yantai Center for Diseases Prevention and Control,Yantai 264003，China)

A self-assembly pipette tip solid-phase extraction(PTSPE)/high-resolution benchtop Q Exactive mass spectrometric(HRMS) method for the analysis of 15 acidic pesticides in fruit was established.The samples were first extracted with 1%formic acid in acetonitrile,and then the extracts were cleaned up using PTSPE procedure with the adsorbent of PEP and HILIC.The chromatographic analysis was performed on a T3 column.And the qualitative and quantitative analyses were performed under tSIM/ddMS2mode by high resolution mass spectrometry.The internal standard calibration was used for quantification,and the method showed a good linearity(r2>0.99) in a certain concentration range for the 15 acidic pesticides.The limits of quantitation(LOQ) were between 0.2 μg/kg and 10 μg/kg.The recoveries of the analytes in apples,cherry tomatoes and strawberries samples at spiked levels of LOQ,10 μg/kg and 100 μg/kg ranged from 73.5%to 115.9%,with relative standard deviations(RSDs) of 1.0%-8.3%.The results showed that the method was sensitive and accurate,and was suitable for the analysis of acidic pesticides in fruit．

pipette tip solid-phase extraction(PTSPE)；ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry(UPLC-HRMS); fruit; acidic pesticides

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.005

2016-09-28；

2016-11-07

國家食品安全風險評估中心高層次人才隊伍建設523項目

*通訊作者：陳達煒，博士，副研究員，研究方向：食品衛生，Tel：010-67779768，E-mail:chendw@cfsa.net.cn

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2017)01-0031-06