酪氨酸四肽與ct-DNA的相互作用

孫志杰，呂名秀，盧 奎，段冰潮，劉廣斌

(1.鄭州大學 化學與分子工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南工程學院 材料與化學工程學院，河南 鄭州 450007)

酪氨酸四肽與ct-DNA的相互作用

孫志杰1,2，呂名秀1,2，盧 奎2*，段冰潮1，劉廣斌1

(1.鄭州大學 化學與分子工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南工程學院 材料與化學工程學院，河南 鄭州 450007)

采用Fmoc固相合成法合成了酪氨酸四肽(YYYY)，經液相色譜-高效液相色譜(RP-HPLC)純化，并用電噴霧質譜(ESI-MS)表征后，得到純度大于90%的四肽，利用紫外光譜、圓二色光譜和熒光光譜研究了肽YYYY與ct-DNA的相互作用。結果表明，隨著肽濃度的增加，ct-DNA的紫外吸收產生明顯的增色效應，熒光猝滅顯著，圓二色光譜發生紅移。研究推測酪氨酸四肽以溝槽方式與ct-DNA發生相互作用，且酪氨酸四肽與ct-DNA的作用強于酪氨酸。

酪氨酸四肽；ct-DNA；相互作用；Fmoc固相合成法

白癲瘋是一種常見的后天性表皮色素脫失性皮膚病，主要與人體酪氨酸酶的缺失有關。白癜風患者食用含有酪氨酸的食物可以促進黑色素的形成，減輕白癜風癥狀。酪氨酸是酪氨酸酶單酚酶功能的催化底物，是最終形成優黑素和褐黑素的主要原料[1]。小肽是生命體內的基本配體，是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質，可以調節體內各個系統和細胞的生理功能，激活體內有關酶系，促進中間代謝的通透性，或是通過控制DNA轉錄或影響特異的蛋白合成，最終產生特定的生理效應，發揮其藥理作用[2-3]。與氨基酸相比，寡肽的吸收速度和效率更高，且其可由腸道不經降解直接吸收[4]。由此可以推測，酪氨酸寡肽比酪氨酸具有更高的生物活性。為了考察酪氨酸寡肽的性質及其在生物醫藥領域的應用價值，本文研究了酪氨酸及酪氨酸四肽與ct-DNA的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientific LCQ Fleet離子阱質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；MOS-500圓二色譜儀(法國Bio-logic公司)；UV-3600紫外可見近紅外分光光度計(日本Shimadzu公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(澳大利亞Agilent公司)；Thermo ScientificLGJ-10冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠)；SZ-93自動雙重純水蒸餾儀(上海亞榮生化儀器廠)；PHS-3C型精密PH計(上海精密科學儀器有限公司)；多肽固相合成管(鄭州利研科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵和HJ-1磁力攪拌儀(鞏義市英峪予華儀器廠)。

小牛胸腺DNA(ct-DNA，Sigma 公司),直接溶于pH 7.0 的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液中，純度以260 nm與280 nm處吸光度的比值檢測確定(A260/A280=1.89>1.80，符合實驗要求)；溴化乙錠(EB，Sigma公司)；酪氨酸四肽(實驗室合成)，通過液相色譜測定其純度為94.50%;Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang Resin(0.39 mmol/g)、Fmoc-Tyr-(tBu)-OH、1-羥基苯并三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、酪氨酸均購于上海吉爾生化有限公司；哌啶(國藥化學試劑有限公司)；二甲基甲酰胺(DMF)、茚三酮、乙腈(色譜純)、苯酚、二氯甲烷、乙醚(天津市科密歐化學試劑有限公司)；三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚、乙二硫醇(阿拉丁試劑上海有限公司)；其它試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 Tyr-Tyr-Tyr-Tyr的合成稱量Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang Resin 1.50 g于干燥的固相合成管中，加入10 mL DMF，用氮氣攪拌溶脹30 min后減壓抽濾，再加入 10 mL 20%的哌啶DMF溶液，30 min后脫洗，用茚三酮溶液檢測，若顏色變為深紫色或黑色則脫保護完成，否則重復上述過程直至脫除完全。合成管中加入偶聯液，避光氮氣保護下反應4 h，脫洗，檢測樹脂不變色則偶聯完全，否則二次投料重復偶聯。重復以上步驟直至酪氨酸四肽合成，切割洗滌，置于通風櫥中晾干，得到粗產品[5-6]。

1.2.2 高效液相色譜分離純化將固相合成得到的粗產品用水或甲醇溶解，進行液相色譜分離。液相色譜條件:Agilent ZORBAX300SB-C18色譜柱(9.40 mm×250 mm，5 μm);柱溫為室溫;進樣量200 μL;流動相為70%A+30%B(A 液為0.10%三氟乙酸溶液，B液為含0.10%三氟乙酸的乙腈溶液);流速1.00 mL/min;檢測波長220 nm。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜測定在比色皿中加入3 mL ct-DNA溶液(cct-DNA=5.0×10-5mol/L),向其中滴加一系列的肽，振蕩靜止15 min，其加入量以一系列Rt(Rt1=cTyr/cct-DNA;Rt2=cTyr-Tyr-Tyr-Tyr/cct-DNA)值決定，進行紫外光譜掃描。

1.2.4 熒光光譜測定肽濃度對ct-DNA的影響：于一系列10 mL比色管中加入DNA-EB溶液(cct-DNA=5.0×10-5mol/L，cEB=5.0×10-6mol/L),再加入一定量的Tyr和Tyr-Tyr-Tyr-Tyr溶液，其加入量以一系列Rt(Rt1=cTyr/cct-DNA;Rt2=cTyr-Tyr-Tyr-Tyr/cct-DNA)值決定，用Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.0)稀釋至刻度，搖勻，37 ℃下放置1 h，測定其熒光發射光譜(λex=260 nm，狹縫(寬度)Ex=Em=5 nm)。

ct-DNA的熱變性溫度的測定：DNA的變性溫度Tm是指DNA在加熱過程中雙螺旋結構失去一半時的溫度。配制一系列DNA-EB(cct-DNA=5.0×10-5mol/L，cEB=5.0×10-6mol/L)溶液，再分別加入適量濃度的肽溶液，取3 mL至比色皿中，從25 ℃升溫至100 ℃，每隔5 ℃進行熒光發射光譜掃描,以F25 ℃/Ft對溫度T作圖。

1.2.5 圓二色光譜測定配制DNA-Tris溶液(cct-DNA=5.0×10-5mol/L)，取3 mL至比色皿中，向其中滴加一系列的肽，振蕩靜止15 min，測定其圓二色光譜信號。

2 結果與討論

2.1 Tyr-Tyr-Tyr-Tyr的液相色譜純化及質譜檢測

對純化后的Tyr-Tyr-Tyr-Tyr進行RP-HPLC檢測，并經面積歸一法計算得到其純度為94.50%。對其進行質譜圖掃描，在m/z=671.17觀察到酪氨酸四肽的分子離子峰，表明產品的純度較高。收集純化目標產物，經冷凍干燥得白色粉末狀酪氨酸四肽。

2.2 紫外光譜

小分子與ct-DNA發生相互作用后，可根據ct-DNA吸收峰強度的變化以及特征吸收峰的位移來判斷小分子與ct-DNA發生的相互作用。ct-DNA中含有芳香性堿基和磷酸生色團，其電子吸收光譜在260 nm左右有強的吸收峰。當小分子與ct-DNA相互作用的吸收光譜同時出現減色和紅移現象時，說明ct-DNA分子的軸向發生變化，即構象改變，可認為小分子與ct-DNA相互作用的模式為嵌插模式[7]。從圖1可以看出，隨著肽濃度的增加，ct-DNA在260 nm處的最大吸收峰均出現了增色效應，并且伴有微弱的紅移。表明肽與ct-DNA相互作用的模式不是經典的嵌插模式，可能是靜電或溝槽結合方式。ct-DNA的堿基是紫外光譜的生色團，在正常情況下，ct-DNA的堿基被包裹在ct-DNA磷酸骨架內部，由于肽鏈含有酪氨酸，側鏈攜帶有胺基，可以伸入DNA螺旋內部作用于DNA的堿基，同時由于DNA堿基疏水區域與肽鏈骨架的疏水作用力，導致DNA堿基對之間的氫鍵作用力受到影響，使DNA的堿基對更多的暴露出來，致使整個DNA的紫外吸收增加[8]。圖中表明Tyr-Tyr-Tyr-Tyr(YYYY)對ct-DNA的增色效應明顯增加，這可能是由于酪氨酸四肽結構中還有較多的酪氨酸殘基等芳香基團，使其與ct-DNA的溝槽作用比酪氨酸更強。

2.3 熒光光譜

溴化乙錠(EB)作為一個具有共軛芳香平面型結構的分子，本身熒光很弱，嵌入到雙螺旋內部的堿基對后可使ct-DNA 熒光顯著增強[9]。當EB 從雙螺旋中出來或雙螺旋減少時，熒光強度會顯著降低，因而EB 可作為ct-DNA 結構的熒光探針。如果體系中存在其它能與ct-DNA 發生作用的小分子時，該分子會與EB 競爭與ct-DNA 結合，并將EB 從雙螺旋中擠出，從而減弱與EB-DNA 體系的熒光強度，而體系的熒光強度減弱程度與小分子和ct-DNA 結合作用的強度存在對應關系[10]。因此，可借助小分子對EB-DNA體系熒光強度的影響，研究其與ct-DNA 作用的情況。

2.3.1 肽濃度對ct-DNA的影響測定了不同濃度的酪氨酸和酪氨酸四肽分別與DNA-EB體系在600 nm處的熒光強度(圖2)。由圖2可知，隨著EB-DNA 體系中Tyr 及Tyr-Tyr-Tyr-Tyr 濃度的增加，體系在600 nm處的熒光強度逐漸減弱，表明二者均對EB-DNA 體系有熒光猝滅作用，且Tyr-Tyr-Tyr-Tyr的猝滅作用更強。

2.3.2 熒光猝滅方式的判斷及結合常數的計算熒光猝滅過程可分為動態猝滅和靜態猝滅。靜態猝滅是基態配合物的生成往往引起熒光物質吸收光譜的改變，是由于猝滅劑與熒光物質在基態時生成不發熒光的配合物所致。動態猝滅是熒光物質分子處于激發態時與猝滅劑分子相互碰撞，導致熒光發生猝滅，該方式只影響熒光分子的激發態，并不改變熒光物質的吸收光譜[11-12]。如果Tyr-Tyr-Tyr-Tyr對DNA-EB體系為動態猝滅過程，其作用過程遵循Stern-Volmer方程[13]：F0/F=1+Kqτ0[Q]。式中，F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時體系的熒光強度;Kq為猝滅常數;τ0為不存在猝滅體時熒光分子的平均壽命(生物大分子的熒光壽命約為10-8s);[Q]為體系猝滅劑的濃度。根據公式計算得出Tyr-Tyr-Tyr-Tyr對EB-DNA 的猝滅常數Kq=5.89×1012，大于Tyr 的猝滅常數，且兩者均大于小分子化合物與生物大分子之間最大擴散控制的碰撞常數2.00×1010L·mol-1·s-1，證明兩者對ct-DNA體系的猝滅作用不是擴散和碰撞所引起的動態猝滅，而是Tyr和Tyr-Tyr-Tyr-Tyr “鑲嵌”在ct-DNA 雙螺旋結構中，形成了某種特定結構的化合物所引起的靜態猝滅[14]。

表1 酪氨酸四肽、酪氨酸與DNA-EB體系在不同溫度下的熒光猝滅常數

靜態猝滅過程遵循下式方程：F0/F=1+Ksv[Q]，式中，Ksv為靜態猝滅常數。 以F0/F對[Q]作一元線性擬合，可得到肽Tyr-Tyr-Tyr-Tyr在T=310，300，290 K時的Ksv值。由圖3和表1可看出，隨著溫度的升高，肽的Ksv值逐漸減小，這符合靜態猝滅的特征[15]，且兩者的Kq值均大于小分子化合物與生物大分子之間最大擴散控制的碰撞常數(2.00×1010L·mol-1·s-1)，這說明肽對DNA-EB復合物體系的猝滅作用是靜態猝滅。由表知Tyr-Tyr-Tyr-Tyr 的Ksv大于Tyr 的Ksv，說明酪氨酸四肽比酪氨酸能更好地與ct-DNA 發生相互作用。

圖4 酪氨酸四肽、酪氨酸與DNA-EB體系的熱變性曲線Fig.4 The melting curve of DNA-EB in the presence of YYYY and Y cct-DNA=5.0×10-5 mol/L,cEB=5.0×10-6 mol/L,cYYYY=cY=5.0×10-5 mol/L

2.3.3 ct-DNA的熱變性通過測定ct-DNA的熱變性溫度(Tm)可以區分小分子與ct-DNA的作用模式[16]。由圖4可知，ct-DNA-EB復合物體系的熱變性溫度為95 ℃，隨著肽的加入，ct-DNA-EB-肽體系的熱變性溫度相比于ct-DNA-EB體系均下降。說明肽的加入使得EB對ct-DNA的嵌插作用減弱或EB在ct-DNA堿基對之間的嵌入量減少，導致ct-DNA的穩定性降低，熱變性溫度下降。小分子與ct-DNA相互作用，嵌插結合模式使ct-DNA的熱變性溫度顯著增高，一般為5～8 ℃；靜電作用使ct-DNA雙螺旋收縮，結構穩定性增加，熱變性溫度呈上升趨勢；溝槽結合模式對ct-DNA的熱變性溫度影響不大甚至出現下降[17]。由圖可看出，肽的加入對ct-DNA-EB體系的熱變性溫度影響變化均在5 ℃以內，且均使ct-DNA的熱變性溫度降低，說明肽與ct-DNA的作用方式主要為溝槽模式。

2.4 圓二色光譜

對不同濃度的肽與ctDNA體系的圓二色光譜進行掃描(圖5)。從圖5可以觀察到，ct-DNA的特征CD信號為247 nm處的負峰和275 nm處的正峰，前者由DNA的B型螺旋結構產生，后者由于DNA的堿基堆積引起[18]。隨著Tyr-Tyr-Tyr-Tyr和Tyr濃度的不斷增加，ct-DNA在275 nm處的正峰強度明顯減弱且伴隨紅移。CD信號的明顯下降表明肽與ctDNA的相互作用主要發生在與ctDNA堿基之間的作用，肽的加入使ct-DNA堿基對之間的π-π堆積作用受到嚴重的影響，致使相應的信號峰下降。小分子化合物與ct-DNA發生嵌插模式的作用，會使ct-DNA堿基堆積程度增高，同時使ct-DNA螺旋結構變得松散，導致ct-DNA的CD信號峰變化是247 nm處的負峰收縮，275 nm處的正峰增高[19]，而本實驗結果正好與此相反，因此肽與ct-DNA的相互作用不是嵌插模式。與嵌插作用模式不同，小分子結合到ct-DNA的溝槽區后引起堿基的松動[20]，說明肽與ct-DNA的相互作用主要是溝槽模式，且Tyr-Tyr-Tyr-Tyr與ct-DNA的作用比Tyr強。

3 結 論

本文利用固相合成法合成了純度較高的酪氨酸四肽，并通過熒光光譜法、紫外光譜法、圓二色光譜法對Tyr-Tyr-Tyr-Tyr和Tyr與ct-DNA的作用方式進行了考察。結果表明Tyr-Tyr-Tyr-Tyr和Tyr與ct-DNA以溝槽方式與ct-DNA發生相互作用，且酪氨酸四肽與ct-DNA的作用強于酪氨酸。

[1] Lauren C S,Robert A H.Neuropharmacology,2007,53：791-800.

[2] Li H,Yu Y Y,Hu X，Cao S W.Spectrosc.SpectralAnal.(李華，余燕影，胡昕,曹樹穩.光譜學與光譜分析),2008,28(8):1905-1909.

[3] Clareand D A,Swaisgood H E.J.Dairy,2000,82(1):1187.

[4] Li H,Zhao W J,Cao S X,Lu K,Zhao Y F.Chem.J.Chin.Univ.(李紅，趙文杰，曹書霞，盧奎，趙玉芬.高等學校化學學報),2004,25(10):1866-1868.

[5] Chan W C,White P D.OxfordUniversityPress,2000,38(6):61-62.

[6] Li R,Lu K,Ma L,Cao S X,Zhao Y F.Chin.J.Anal.Lab.(李銳，盧奎，馬麗,曹書霞，趙玉芬.分析試驗室),2007,26(9):21-25.

[7] He J X,Jiang C Q,Gao M X.Spectrosc.SpectralAnal.(賀吉香，江崇球，高明霞.光譜學與光譜分析),2003,23(4):755-758.

[8] Lu Y J,Zhang R R,Du Z Y，Fang Y X,Zhang K.Chin.J.Spectrosc.Lab.(盧宇靖，張瑞瑞，杜志云，方巖雄，張焜.光譜實驗室),2011,28(4):1565-1569.

[9] Jin L,Yang P,Li Q S.Chem.J.Chin.Univ.(靳蘭，楊頻，李青山.高等學校化學學報),1996,17(9):1345-1348.[10] Yang G J,Xu J J,Chen H Y.Chem.J.Chin.Univ.(楊功俊，徐靜娟，陳洪淵.高等學校化學學報),2004,25(7):1235-1239.

[11] Han B X,Zhang H,Wu F Y.Chin.J.Anal.Lab.(韓丙星，張華，吳芳英.分析試驗室),2012,31(12):1-4.

[12] Zhao D X,Sun J,Zhu Q C，Lu K.Chem.J.Chin.Univ.(趙東欣，孫靜，朱其叢,盧奎.高等學校化學學報),2013,34(9):2114-2119.

[13] Long E C,Barton J K.Acc.Chem.Res.,1990,23:271-273.

[14] Lu K,Cheng H L,Ma L，Zhao D X,Yang L R,Zhao Y F.Spectrosc.SpectralAnal.(盧奎，成紅麗，馬麗,趙東欣，楊亮茹，趙玉芬.光譜學與光譜分析),2010,30(1):146-149.

[15] Ma L,Zhao D X,Ren H P，Lu K.AsianJ.Chem.,2011,23(5):2020-2022.

[16] Guan X,Liu J,Su X N.J.Instrum.Anal.(管驍，劉靜，蘇淅娜.分析測試學報),2014,33(10):1116-1122.

[17] Guo Y H,Chen X L,Zhang T,Qu L B,Zhao Y F,Yu Y Z.Spectrosc.SpectralAnal.(郭玉華，陳曉嵐，張婷，屈凌波，趙玉芬，郁有祝.光譜學與光譜分析),2006,26(3):475-479.

[18] Zhang G W,Wang L H,Zhou X Y，Li Y,Gong D M.J.Agric.FoodChem.,2014,62:991-1000.

[19] Li J X,Zhao J Q,Yin X F,Sun C J,Chen J H,Zheng L,Wang X R.J.Instrum.Anal.(李景喜，趙金泉，尹曉裴，孫承君,陳軍輝，鄭立，王小如.分析測試學報),2016,35(6):668-673.

[20] Yang W,Yuan F,Gao Y X.Spectrosc.SpectralAnal.(楊偉，袁芳，高彥祥.光譜學與光譜分析),2015,35(1):184-188.

Studies on Interaction of Tyr-Tyr-Tyr-Tyr with ct-DNA

SUN Zhi-jie1,2,Lü Ming-xiu1,2,LU Kui2*，DUAN Bing-chao1,LIU Guang-bin1

(1.College of Chemistry and Molecular Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001，China;2.School of Material and Chemical Engineering,Henan University of Engineering,Zhengzhou 450007，China)

A model peptide,Tyr-Tyr-Tyr-Tyr(YYYY),was synthesized by Fmoc solid-phase methods,purified and separated by reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC),and characterized by ESI-MS analysis.The interaction of peptide with calf thymus DNA(ct-DNA) was investigated by UV-Vis absorption spectra,circular dichroism(CD) and fluorescence spectra.The results showed that,with the increase of peptide concentration,there were a hyperchromic effect on UV spectra,a remarkable fluorescence quenching and a red shift of CD.It is possible that Tyr-Tyr-Tyr-Tyr and Tyr might interact with ct-DNA via the groove binding mode.The interaction between Tyr-Tyr-Tyr-Tyr and ct-DNA,compared with that between Tyr and ct-DNA,is more stronger.

Tyr-Tyr-Tyr-Tyr;ct-DNA;interaction;Fmoc solid-phase methods

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.017

2016-07-07；

2016-09-28

國家自然科學基金項目(21572046)；河南省教育廳自然科學基金項目(14A150017)

*通訊作者：盧 奎,博士，教授，研究方向：有機化學與化學生物學研究，Tel：0371-62509959,E-mail：lukui126@126.com

O657.3；O629.72

A

1004-4957(2017)01-0101-06