復治肺結核患者對氟喹諾酮類藥物交叉耐藥情況的體外研究

崔振玲 陸俊梅 楊華 黃曉辰 肖和平

·論著·

復治肺結核患者對氟喹諾酮類藥物交叉耐藥情況的體外研究

崔振玲 陸俊梅 楊華 黃曉辰 肖和平

目的 分析復治肺結核患者結核分枝桿菌臨床分離株對氟喹諾酮類藥物體外交叉耐藥情況。 方法 收集2009—2010年來自全國13個地區的結核病防治機構的175例未治療前的復治結核病患者。使用BACTEC MGIT 960系統(簡稱“MGIT 960”)和最低抑菌濃度法(MIC)兩種方法檢測結核分枝桿菌分離株對氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)和莫西沙星(Mfx)藥物的敏感性，分析3種氟喹諾酮類藥物的交叉耐藥情況。 結果 MGIT 960檢測結果顯示，100.0%(132/132)對Ofx敏感的菌株對Lfx和Mfx敏感；100.0%(131/131)對Mfx敏感的菌株對Lfx敏感，99.2%(130/131)對Ofx敏感；對Lfx敏感的菌株中85.7%(132/154)對Ofx敏感，85.1%(131/154)對Mfx敏感。對Ofx耐藥的菌株中48.8%(21/43)同時耐Lfx，97.7%(42/43)同時耐Mfx；對Lfx耐藥的菌株中100.0%(21/21)同時耐Mfx與Ofx；耐Mfx的菌株中95.5%(42/44)同時耐Ofx，47.7%(21/44)同時耐Lfx。MIC值檢測結果顯示，對Ofx耐藥的菌株中86.0%(37/43)同時耐Lfx，7.0%(3/43)同時耐Mfx；對Lfx耐藥的菌株中8.1%(3/37)同時耐Mfx，100.0%(37/37)同時耐Ofx；3株對Mfx耐藥的菌株均同時耐Ofx和Lfx。結論 復治肺結核患者臨床分離株對Ofx與Lfx具有較高的雙向交叉耐藥；但Ofx和Lfx兩種藥物與Mfx之間的正向交叉耐藥率較低，臨床治療時最好結合MIC值檢測結果而擇優選藥。

結核, 肺； 喹諾酮類； 微生物敏感性試驗； 評價研究

近年來，由于耐藥結核病的蔓延，常規一線抗結核藥物化療效果不佳，加劇了耐藥結核病尤其耐多藥結核病(MDR-TB)的流行。研究顯示，氟喹諾酮類藥物對結核分枝桿菌具有較好的殺菌效果[1-3]，因此，其用于治療耐藥結核病或者復治結核病患者倍受關注[4]。隨著耐藥結核分枝桿菌的傳播，氟喹諾酮類藥物在結核病治療中遇到了較大的挑戰，如何更有效合理地使用氟喹諾酮類藥物是臨床亟待解決的問題。氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)和莫西沙星(Mfx)均屬于氟喹諾酮類藥物，其中，Lfx和Mfx作為新一代氟喹諾酮類藥物被廣泛使用。已有研究顯示，Mfx治療MDR-TB患者效果優于Lfx，治療初治結核病患者優于Ofx[4-6]，但是對復治結核病患者臨床分離株對上述3種氟喹諾酮類藥物之間的交叉耐藥情況尚不清楚。本研究將復治肺結核患者結核分枝桿菌臨床分離株進行體外氟喹諾酮類藥物的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，以觀察交叉耐藥情況，為臨床合理使用氟喹諾酮類藥物提供實驗室依據。

材料和方法

一、 菌株來源

選取2009—2010年來自全國13個地區結核病防治機構的175例尚未開始治療的復治肺結核患者作為研究對象，患者來源見表1。175例復治肺結核患者中，28例患者有氟喹諾酮類藥物用藥史，147例患者無氟喹諾酮類藥物用藥史。共分離得到175株菌株，所有分離株均經過對硝基苯甲酸(PNB)菌種鑒定，結果為結核分枝桿菌。以H37Rv菌株作為標準株[上海市肺科醫院結核病(肺)重點實驗室菌株庫提供]。

二、試劑與儀器

BACTEC MGIT 960系統(簡稱“MGIT 960”)7 ml 培養管和分枝桿菌營養添加劑(OADC)均購自美國BD公司； Ofx、Lfx藥粉購自美國Sigma公司；Mfx原藥藥粉由德國拜耳公司提供；96孔無菌U型板購自浙江拱東醫療科技有限公司。3種氟喹諾酮類藥物原粉在配制使用時均根據試劑標識的純度計算有效濃度。

三、MGIT 960進行藥敏試驗的程序

所有菌株進行對Ofx、Lfx和Mfx的藥敏試驗。檢測方法參照WHO推薦的MGIT 960采用的藥物濃度進行[7-9]。Ofx、Lfx和Mfx的終濃度分別為2 μg/ml、2 μg/ml和0.25 μg/ml。檢測管：向7 ml MGIT 960內加入0.8 ml OADC、0.1 ml藥物儲存液，再加入0.5 ml的菌液(0.5 mg/ml)。對照管：向7 ml MGIT 960培養管加入0.8 ml OADC，再加入0.5 ml的菌液(0.005 mg/ml)。放入MGIT 960儀器中，選擇未知藥敏試驗程序，由儀器自動判讀結果，時間4～13 d。

表1 175例復治肺結核患者來源及背景資料

四、最低抑菌濃度(MIC)檢測

MIC檢測在96孔U型板中進行，具體操作參考文獻[10]，每個藥物共設8個濃度，由高到低進行倍比稀釋，Ofx 濃度為0.125～16 μg/ml；Lfx濃度為0.125～16 μg/ml；Mfx濃度為0.0625～8 μg/ml。設置1%菌量為對照孔，加藥孔內菌量<1%對照孔內菌量判定為結核分枝桿菌生長受到抑制，能抑制結核分枝桿菌生長的最低藥物濃度判定為MIC值。根據文獻[11-12]，Ofx、Lfx和Mfx的藥敏試驗判斷界值均設定為2 μg/ml，即當MIC值≥判定界值時判斷為耐藥，反之則為敏感。

五、交叉耐藥分析

Ofx耐藥株同時耐Lfx、Ofx耐藥株同時耐Mfx、Lfx耐藥株同時耐Mfx的百分率定義為正向交叉耐藥率；反之，Mfx耐藥株同時耐Lfx、Mfx耐藥株同時耐Ofx、Lfx耐藥株同時耐Ofx的百分率定義為反向交叉耐藥率。

六、統計學分析

采用SPSS 11.5統計學軟件進行統計處理，不同藥物耐藥率的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、MGIT 960法藥敏試驗及交叉耐藥分析

MGIT 960法藥敏試驗結果顯示，175株結核分枝桿菌臨床分離株對Ofx、Lfx和Mfx的耐藥率分別為24.6%(43/175)、12.0%(21/175)和25.1%(44/175)；Ofx耐藥率明顯高于Lfx，差異有統計學意義(χ2=6.41，P=0.014)；與Mfx耐藥率相比，差異無統計學意義(χ2=0.09，P=1.000)。

147株無氟喹諾酮類用藥史患者的臨床分離株，對Ofx、Lfx和Mfx的耐藥率分別為23.8%(35/147)、10.9%(16/147)和23.8%(35/147)；28株有用藥史患者的臨床分離株，對Ofx、Lfx和Mfx的耐藥率分別為28.6%(8/28)、17.9%(5/28)和32.1%(9/28)；有無用藥史患者的分離株對Ofx、Lfx和Mfx的耐藥率比較，差異均無統計學意義(χ2=0.17，P=0.652；χ2=0.82，P=0.361；χ2=0.50，P=0.502)。

175例復治肺結核患者中，耐多藥肺結核患者60例，對Ofx、Lfx和Mfx的耐藥率分別為53.3%(32/60)、30.0%(18/60)、55.0%(33/60)；對4種一線抗結核藥物鏈霉素、異煙肼、利福平和乙胺丁醇全敏感患者81例，其對Ofx、Lfx和Mfx的耐藥率分別為3.7%(3/81)、1.2%(1/81)、3.7%(3/81)；耐多藥患者與全敏感患者結核分枝桿菌臨床分離株對Ofx、Lfx和Mfx耐藥率比較，差異均有統計學意義(χ2=26.85，P<0.01；χ2=18.25，P<0.01；χ2=27.74，P<0.01)。

根據MGIT 960藥敏試驗結果分析，對Ofx耐藥的菌株有43株，其中21株同時耐Lfx，42株同時耐Mfx；對Lfx耐藥的菌株有21株，21株均同時耐Ofx，也同時耐Mfx；對Mfx耐藥的菌株有44株，其中42株同時耐Ofx，21株同時耐Lfx。Ofx和Lfx、Ofx和Mfx、Lfx和Mfx正向交叉耐藥率分別為48.8%(21/43)、97.7%(42/43)和100.0%(21/21)；反向交叉耐藥率分別為100.0%(43/43)、95.5%(42/44)和47.7%(21/44)。132株對Ofx敏感的菌株均對Lfx和Mfx敏感；154株對Lfx敏感的菌株中，有132株對Ofx同時敏感，131株同時對Mfx敏感；131株對Mfx敏感的菌株中，130株對Ofx敏感，所有Mfx敏感株均同時對Lfx敏感。

二、MIC法藥敏試驗及交叉耐藥分析

43株對Ofx耐藥的菌株用MIC法進行藥敏試驗，Ofx的MIC值分布位于2～>16 μg/ml 之間，Lfx的MIC值分布位于1～16 μg/ml之間，Mfx的MIC值分布位于0.25～4 μg/ml之間(表2)。43株對Ofx耐藥的菌株采用MIC法進行藥敏試驗，結果對Lfx和Mfx的耐藥率分別為86.0% (37/43)和7.0%(3/43)。

43株對Ofx耐藥的菌株中，Lfx與Ofx相同的MIC菌株僅1株(2.3%)；35株(81.4%)菌株對Ofx的MIC值為Lfx的2倍，7株(16.3%)菌株對Ofx的 MIC值為Lfx的4倍(表3)。無對Ofx與Mfx的MIC值相同的菌株，且無對Lfx與Mfx的MIC值相同的菌株。5株(11.6%)菌株對Lfx的 MIC值為Mfx的2倍，25株(58.1%)菌株對Lfx的 MIC值為Mfx的4倍，13株(30.2%)菌株對Lfx的MIC值為Mfx的8倍及以上(表4)。

表2 43株對Ofx耐藥的菌株對3種氟喹諾酮類藥物的MIC值分布情況(株)

表3 對Ofx耐藥菌株的Ofx和Lfx 的MIC值分布(株)

表4 對Ofx耐藥菌株的Lfx和Mfx 的MIC值分布(株)

根據MIC藥敏試驗結果分析，耐Ofx同時耐Lfx的菌株有37株，同時耐Mfx的菌株有3株；耐Lfx同時耐Ofx的菌株有37株，同時耐Mfx的菌株有3株；耐Mfx同時耐Ofx的菌株有3株，同時耐Lfx的菌株有3株。Ofx和Lfx、Ofx和Mfx、Lfx和Mfx正向交叉耐藥率分別為86.0%(37/43)、7.0%(3/43)和8.1%(3/37)；反向交叉耐藥率均為100.0%(37/37、3/3和3/3)。

討 論

氟喹諾酮類藥物因其與一線抗結核藥物的殺菌機制不同，因此被廣泛用于耐藥結核病的治療[13-14]。目前，已知氟喹諾酮類藥物的耐藥機制基本一致，均為編碼DNA螺旋酶的基因發生突變導致耐藥[15]。 它作為有效的抗結核藥物，已經被寫入耐藥結核病化學治療指南，目前也正被作為治療復治肺結核的候選藥物進行研究。我國新版《耐藥結核病化療指南 2015年》中將氟喹諾酮類藥物作為治療MDR-TB的重要藥物， WHO在《耐藥結核病規劃管理指南》中建議優先選用Mfx及加替沙星等新一代氟喹諾酮類藥物，同時指出要根據藥敏試驗結果選用氟喹諾酮類藥物。盡管WHO認為在選用氟喹諾酮類藥物治療耐藥結核病時，新一代藥物Mfx和Lfx對Ofx耐藥的菌株可能有效，但仍缺乏可信的研究予以證明[16-17]。隨著氟喹諾酮類藥物在復治肺結核治療中的廣泛應用，越來越多的醫療機構根據臨床需求開展氟喹諾酮類藥物的藥敏試驗，其中多數醫療機構僅對其中1種或2種藥物進行藥敏試驗，對氟喹諾酮類藥物的交叉耐藥情況缺乏系統的研究。

目前，氟喹諾酮類藥物藥敏試驗的方法有MGIT 960、BACTEC 460、羅氏培養、米氏7H10培養等，但僅有WHO推薦的MGIT 960法可以同時進行3種氟喹諾酮類藥物的藥敏試驗[7]。為了避免方法學的不一致性而導致的研究差異，本研究首先采用MGIT 960對上述3種藥物進行藥敏試驗。MGIT 960藥敏試驗結果顯示，對Ofx敏感的菌株對Lfx和Mfx同時敏感；對Mfx敏感的菌株對Ofx和Lfx也基本全部敏感，提示在采用MGIT960進行藥敏試驗時，如果Ofx或者Mfx檢測結果為敏感，則該菌株基本對3種氟喹諾酮類藥物均敏感。但是對Lfx敏感的菌株，不一定對Ofx和Mfx同時敏感，應對臨床用藥進行有針對性的藥敏試驗檢測。對于耐藥株，MGIT 960藥敏試驗交叉耐藥結果顯示Ofx與Lfx雖然正向存在交叉耐藥，但Ofx耐藥菌株仍有可能對Lfx敏感，可以通過對Lfx進行藥敏試驗來判斷是否可以選用Lfx治療；但是Ofx和Mfx、Lfx和Mfx正向交叉耐藥率接近100%，這與目前WHO和我國耐藥結核病推薦用藥指南差異較大[4,16]。為了進一步確認上述3種藥物的交叉耐藥率，筆者選用MIC法進一步對3種氟喹諾酮類藥物的交叉耐藥情況進行分析。

MIC法結果顯示，大多數菌株對Lfx的MIC值低于Ofx；對Mfx的MIC值低于Lfx，與報道的Lfx抗結核效果優于Ofx，Mfx優于Lfx一致[4-6]。MIC檢測交叉耐藥結果顯示，除Ofx和Lfx存在較高的正向交叉耐藥外，Ofx和Mfx、Lfx和Mfx盡管存在正向交叉耐藥，但交叉耐藥率較低，此結果支持目前WHO和我國的耐藥結核病指南推薦用藥方案[4-6,16]，提示臨床治療中Ofx和Lfx耐藥的患者仍可能采用Mfx進行有效治療。但是上述3種藥物的反向交叉耐藥率則均為100%。盡管本方法中Mfx耐藥株較少，還需要擴大標本進行驗證，但是100%的反向耐藥率提示臨床治療中如果患者對Mfx耐藥，則最好不要考慮再用Ofx和Lfx。

本研究采用了兩種藥敏檢測方法對3種氟喹諾酮類藥物的交叉耐藥進行分析，兩種方法對Ofx與Lfx的正向交叉耐藥率分析較為一致，Mfx與另外2種藥物交叉耐藥率存在較大的差異。原因主要是由兩種方法中檢測Mfx耐藥的濃度不一致所致。MGIT 960中Mfx的藥物濃度遠低于其他2種藥物的濃度，從而導致Mfx的耐藥率高于MIC法的耐藥率，最終導致交叉耐藥率的不同。在已有的研究報道中，判斷對Ofx和Lfx耐藥的MIC判斷界值較一致，但對Mfx耐藥的判斷界值在不同研究中存在較大差異。有研究顯示，當3種氟喹諾酮類藥物使用量均為400 mg時，Lfx最大血藥濃度(Cmax)約為7.463 μg/ml，Ofx的Cmax 約為3.3 μg/ml，Mfx的Cmax約為3.11 μg/ml[16,19]。據此推測，正常藥物攝入量時，3種藥物的有效血藥濃度相近。因此，筆者認為在3種藥物血藥濃度相似的情況下體外藥敏試驗的檢測濃度也應該相近，體外藥敏試驗判斷界值選用同一濃度更為適宜。本研究MIC檢測中對Ofx耐藥菌株對Mfx的耐藥率低于王前等[18]的報道，主要是由于本研究對Mfx 的MIC耐藥判斷界值設定不同導致。

另外，本研究顯示有氟喹諾酮類藥物用藥史患者來源的菌株較無用藥史患者來源的菌株對3種藥物的耐藥率更高，但差異無統計學意義，可能與樣本量較小且分布欠均衡有關，有待進一步研究。盡管如此，仍需規范氟喹諾酮類藥物的使用，防范不規范使用氟喹諾酮類藥物對結核病患者治療所產生的影響。同時，本研究顯示MDR-TB患者對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株明顯高于對一線藥物全敏感的結核病患者的耐藥率，提示采用氟喹諾酮類藥物治療復治MDR-TB患者時需根據藥敏試驗結果選擇用藥。

綜上所述，復治肺結核患者結核分枝桿菌臨床分離株對Ofx與Lfx存在較高的雙向交叉耐藥，但對Ofx與Mfx、Lfx和Mfx的正向交叉耐藥率較低，大部分耐Ofx或者Lfx的菌株對Mfx仍敏感，在臨床治療選擇上述3種氟喹諾酮類藥物時，最好結合MIC值檢測結果進行擇優選藥。

志謝 本研究得到了國家結核病參比實驗室趙雁林教授的指導，以及以下合作單位的大力支持：解放軍第八五醫院、長春市傳染病醫院、成都市傳染病醫院、廣西壯族自治區龍潭醫院、 廣州市胸科醫院、杭州紅十字會醫院、河南省胸科醫院、湖南省結核病醫院、江蘇省疾病預防控制中心、江西省胸科醫院、南通市疾病預防控制中心、南通市第六人民醫院、山東省胸科醫院、太原市結核病醫院、天津海河醫院、新疆維吾爾自治區胸科醫院

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(本文編輯：王然 李敬文)

Analysis ofinvitrocross-resistance to fluoroquinolones among retreatment patients with pulmonary tuberculosis

CUIZhen-ling，LUJun-mei，YANGHua，HUANGXiao-chen，XIAOHe-ping.

ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,TuberculosisClinicalResearchCenter,ShanghaiPulmonaryHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200433,ChinaCorrespondingauthor:XIAOHe-ping,Email:xiaoheping_sars@163.com

Objective To analyze the situation ofinvitrocross-resistance to fluoroquinolones inMycobacteriumtuberculosis(MTB) clinical isolates obtained from retreatment pulmonary tuberculosis (PTB) patients. Methods All MTB clinical isolated strains were collected from 175 retreatment PTB patients who were registered in the TB health facilities of 13 provinces in China from 2009 to 2010. Drug susceptibility testing (DST) was performed to ofloxacin (Ofx), levofloxacin (Lfx) and moxifloxacin (Mfx) by using MGIT 960 system and MIC value assay. Cross-resistances of fluoroquinolones were analyzed according to the results of MGIT 960 system and MIC value assay. Results According to the results of MGIT 960, 100.0% (132/132) strains susceptible to Ofx were also susceptible to Lfx and Mfx. 100.0% (131/131) and 99.2% (130/131) strains susceptible to Mfx were susceptible to Lfx and Ofx, respectively. 85.7% (132/154) and 85.1% (131/154) strains susceptible to Lfx were susceptible to Ofx and Mfx, respectively. 48.8% (21/43) and 97.7% (42/43) strains resistant to Ofx were resistant to Lfx and Mfx respectively. 100.0% (21/21) strains resistant to Lfx were also resistant to Mfx and Ofx. 95.5% (42/44) and 47.7% (21/24) strains resistant to Mfx were resistant to Ofx and Lfx. According to the results of MIC value assay, 86.0% (37/43) and 7.0% (3/43) strains resistant to Ofx were resistant to Lfx and Mfx. 8.1% (3/37)strains resistant to Lfx were resistant to Mfx. Conclusion In MTB clinical isolated strains obtained from retreatment PTB, the cross-resistance rates between Ofx and Lfx were high while the positive cross-resistant rate of between Mfx and Ofx or Lfx was low. So the fluoroquinolones should be chosen according to MIC values when they are used for PTB treatment.

Tuberculosis, pulmonary； Quinolones； Microbial sensitivity tests； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.01.014

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003009)

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫院結核臨床研究中心 上海市結核病(肺)重點實驗室

肖和平，Email：xiaoheping_sars@163.com

2016-06-07)