GeneXpert MTB/RIF技術在結核病早診斷中的應用

路麗蘋 陸斌 劉梅 洪建軍 郭曉芹 高謙

·論著·

GeneXpert MTB/RIF技術在結核病早診斷中的應用

路麗蘋 陸斌 劉梅 洪建軍 郭曉芹 高謙

目的 評估GeneXpert MTB/RIF技術(簡稱Xpert MTB/RIF)檢測結核分枝桿菌(MTB)及其利福平耐藥的可行性。方法 選取2015年1—6月上海市松江區結核病定點醫院結核科門診連續納入、初次就診的疑似結核病患者，共556例。收集患者痰液標本，分別進行涂片抗酸染色鏡檢法(簡稱“涂片法”)、液體分枝桿菌培養管 (MGIT)培養法(簡稱“液體培養法”)、傳統比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)和Xpert MTB/RIF檢測，比較Xpert MTB/RIF法和傳統方法檢測痰標本中MTB及其耐藥性的效能。結果 537例患者經涂片法、液體培養法和Xpert MTB/RIF檢測，陽性率分別為17.32%(93/537)、28.31%(152/537)和28.12%(151/537)。以液體培養為金標準，Xpert MTB/RIF檢測的敏感度和特異度分別為90.60%(135/149)和95.84%(369/385)，且敏感度高于涂片法[涂片法的敏感度為60.53%(92/152)]，差異有統計學意義(χ2=36.71，P<0.01)；Xpert MTB/RIF檢測涂陽標本的敏感度為96.63%(86/89)，明顯高于檢測涂陰標本的敏感度[81.67%(49/60)]，差異有統計學意義(χ2=9.43，P<0.01)。以比例法藥敏試驗結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的敏感度為90.00%(9/10)，特異度為99.07%(106/107)，一致率為98.29%(115/117)。結論 Xpert MTB/RIF技術操作簡便、快速、安全，敏感度和特異度較高，對基層實驗室早期檢測MTB及判定利福平耐藥具有重要價值。

分枝桿菌，結核； 痰； 核酸擴增技術； 早期診斷； 利福平； 抗藥性

目前，國內結核病實驗室檢測結核分枝桿菌(MTB)的常用方法仍然是痰涂片抗酸染色鏡檢、羅氏固體培養和比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。涂片鏡檢法的陽性檢出率低，傳統固體培養和藥敏試驗耗時較長，均難以實現對結核病患者的早期正確診斷和治療[1]。隨著分子生物學診斷技術的不斷發展，GeneXpert MTB/RIF技術(簡稱Xpert MTB/RIF)作為一種利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術，受到了國內外的廣泛關注。該檢測方法針對MTBropB基因81 bp利福平耐藥區間設計引物和探針，檢測其是否發生突變。其完全整合傳統核酸擴增所需的3個主要步驟(核酸提取、擴增和檢測)，僅需將處理后的待檢樣品放入反應盒后，系統就會自動進行核酸提取、被提取物核酸擴增和產物檢測，反應結束后會自動給出實驗結果。Xpert MTB/RIF檢測技術操作簡單、方便，2.5 h之內即可診斷患者是否感染MTB及其是否對利福平耐藥[2-4]，而傳統方法檢測利福平耐藥則需要8周。

依托“十二五”國家科技重大專項支持，上海市松江區對2015年1—6月在該區唯一的結核病定點醫院(上海市松江區中心醫院)結核科門診就診的疑似肺結核患者進行連續6個月監測，對痰液樣本同時進行涂片抗酸染色鏡檢法(簡稱“涂片法”)、液體分枝桿菌培養管 (MGIT)培養法(簡稱“液體培養法”)、傳統比例法藥敏試驗和Xpert MTB/RIF檢測，以評估Xpert MTB/RIF在檢測MTB及其是否對利福平耐藥方面的應用效能，現報告如下。

對象和方法

一、研究對象

選取2015年1—6月上海市松江區中心醫院結核科門診連續納入的初次就診的疑似結核病患者，共556例，收集其痰液標本。

二、試驗方法

1.儀器與試劑：GeneXpert 檢測系統及其配套試劑盒(Cartrige反應盒)購自美國Cepheid公司；痰標本處理液購自美國Cepheid公司；BACTEC MGIT 960系統及其配套試劑(MGIT生長指示管、分枝桿菌培養添加劑試劑盒、分枝桿菌聯合藥敏試劑盒系列)購自美國BD公司；改良羅氏培養基及噻吩-2-羧酸酰肼、對硝基苯甲酸鑒別培養基由上海市疾病預防控制中心培養基室配制；萋-尼抗酸染液購自珠海貝索生物技術有限公司；其他部分試劑為國產分析純。

2.痰涂片檢查：按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[5]中的標準化操作程序執行。

3.液體培養：采用BACTEC MGIT 960培養系統進行液體培養，參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]操作及美國BD醫療器械(上海)有限公司提供的《MGIT液體培養操作手冊》進行標準化操作。取處理好的痰液標本0.5 ml，加入MGIT液體培養管中，放入BACTEC MGIT 960液體培養系統中進行培養；培養陽性的標本進一步行藥敏試驗。

4.傳統生化法菌種鑒別：參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]操作。根據陽性生長對照孔、噻吩-2-羧酸酰肼藥物孔、對硝基苯甲酸藥物孔生長快慢，以及陽性和陰性情況判定鑒定結果。生長緩慢，噻吩-2-羧酸酰肼藥物孔陽性，對硝基苯甲酸藥物孔陰性者鑒定為MTB。

5.藥敏試驗：參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]操作，采用文獻[7]推薦的比例法，應用羅-琴(L-J)培養基，利福平40.0 μg/ml。耐藥判定：根據菌落在培養基上生長情況，若含藥培養基上生長的菌落數與對照培養基上生長菌落數的百分比大于1%，則認為受試菌對該抗結核藥物耐藥。

6.Xpert MTB/RIF檢測：按照Xpert MTB/RIF操作說明書進行。移取1.0 ml痰液至螺旋蓋試管中并加入2.0 ml痰標本處理液，在渦旋振蕩器上振蕩10 s，室溫放置15 min，用專用吸管轉移樣本至專用的樣本反應盒，將樣本反應盒放入Xpert MTB/RIF Dx儀器的樣本艙中，進行DNA提取、PCR擴增和結果的檢測，通過專用軟件判讀結果。

7.質量控制：結核病痰檢實驗室操作人員均參加了國家Xpert MTB/RIF檢測方法和儀器操作的專門培訓，同時均參加每年國家結核病實驗室藥敏檢測熟練度測試。

三、統計學分析

采用Excel 2007軟件收集試驗數據，應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。不同檢測方法間敏感度、特異度、一致率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；一致率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%。

結 果

一、基本情況

對納入的556例患者痰標本分別進行了痰涂片、液體培養及Xpert MTB/RIF檢測，其中13例患者的標本培養污染，4例Xpert MTB/RIF檢測MTB失敗，2例Xpert MTB/RIF 利福平耐藥檢測結果無法判讀，最終納入分析537例。

二、各方法檢測MTB的比較

1.細菌學檢測結果：537例患者痰標本中，涂片法檢查陽性93例(17.32%)，陰性444例(82.68%)；液體培養陽性152例(28.31%)，陰性385例(71.69%)；Xpert MTB/RIF檢測陽性151例(28.12%)，陰性386例(71.88%)。152例液體培養陽性的患者經菌種鑒定為MTB感染者149例，非結核分枝桿菌感染者3例。

2.涂片法與Xpert MTB/RIF檢測結果的比較：93例涂片檢查陽性患者經Xpert MTB/RIF檢測有86例陽性；444例涂片檢查陰性患者經Xpert MTB/RIF檢測有379例陰性。相對于涂片檢查，Xpert MTB/RIF檢測的敏感度為92.47%(86/93)，特異度為85.36%(379/444)。

3.液體培養法與Xpert MTB/RIF檢測結果的比較：149例液體培養陽性的患者中(不包括鑒定為非結核分枝桿菌3例)，經Xpert MTB/RIF檢測有135例陽性；液體培養陰性的385例患者中，Xpert MTB/RIF檢測有369例陰性。相對于液體培養，Xpert MTB/RIF檢測敏感度為90.60%(135/149)，特異度為95.84%(369/385)。

4.以液體培養為金標準比較涂片法和Xpert MTB/RIF檢測的效能：涂片法和Xpert MTB/RIF檢測MTB的敏感度分別為60.53%和90.60%，Xpert MTB/RIF檢測敏感度高于涂片法，差異有統計學意義(χ2=36.71，P<0.01)。涂片法和Xpert MTB/RIF檢測的一致率分別為88.64%和93.85%，Xpert MTB/RIF檢測高于涂片法，差異有統計學意義(χ2=11.35，P=0.010)。具體見表1。

5. Xpert MTB/RIF檢測涂陽及涂陰痰標本的效能：涂片檢查陰性的444例患者，液體培養陽性者60例，Xpert MTB/RIF檢測陽性49例，均為MTB。以液體培養結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測涂陰患者的敏感度為81.67%(49/60)，特異度為95.83%(368/384)。涂片檢查陽性的93例患者，液體培養陽性92例，其中3例經鑒定是非結核分枝桿菌，這3例Xpert MTB/RIF結果為MTB(未檢測出)。除去3例非結核分枝桿菌，其余90例結果見表2。以液體培養結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測涂陽患者的敏感度和特異度分別為96.63%(86/89)和1/1。Xpert MTB/RIF檢測涂陽標本的敏感度高于涂陰標本，差異有統計學意義(χ2=9.43，P<0.01)。

表1 以液體培養為金標準比較涂片法和Xpert MTB/RIF檢測痰液標本的效能

表2 以液體培養結果為金標準比較Xpert MTB/RIF檢測涂片陽性與陰性痰標本的效能

表3 Xpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗檢測培陽患者對利福平耐藥性的結果比較

三、Xpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗檢測利福平耐藥性的比較

液體培養與Xpert MTB/RIF檢測結果均為陽性的135例患者中，18例未做傳統藥敏試驗，同時應用Xpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗進行利福平耐藥檢測的患者共117例，檢測結果見表3。以比例法藥敏試驗檢測結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥的敏感度為90.00%(9/10)，特異度為99.07%(106/107)。

討 論

實驗室檢查是結核病確診尤其是耐多藥結核病確診的重要依據。目前，我國基層結核病實驗室診斷菌陽肺結核仍主要依賴于痰涂片和痰培養等傳統方法。但是，這兩種方法因其檢出率較低，致使部分菌陽肺結核不能被及時發現。因而，探索一種MTB高檢出率的方法，快速、準確診斷肺結核及其耐藥性，對控制結核病疫情具有重要意義。

近年來，Xpert MTB/RIF檢測技術已在多個國家和地區進行了驗證評估[8-11]，Xpert MTB/RIF檢測可自動完成從MTB的DNA提取、擴增、產物檢測到結果報告[15]，且除標本前處理外整個檢測均在封閉的反應盒內進行，全部檢測過程僅需要2.5 h，能夠實現結核病和利福平耐藥的快速檢測。同時，由于其敏感度和特異度較高，為WHO所推薦[12]。

目前，國內報道的對Xpert MTB/RIF檢測的評估研究均以固體培養為金標準，液體培養為金標準者少見。上海市松江區結核病實驗室2012年以來配置了BACTEC MGIT 960儀，對患者的痰標本檢查全面實施液體培養，取代固體培養。本研究即以液體培養為金標準評估Xpert MTB/RIF技術，對國內的相關研究提供了參考價值。

本研究顯示，Xpert MTB/RIF檢測與涂片、液體培養法比較，其敏感度分別為92.47%和90.60%，同其他研究報道的結果相近[3,13]。以液體培養法結果為金標準，涂片法和Xpert MTB/RIF檢測MTB的敏感度分別為60.53%和90.60%，Xpert MTB/RIF檢測的敏感度明顯高于涂片法檢查，結果與其他研究相符[14]。相比液體培養法，Xpert MTB/RIF檢測的報告時間大大縮短，提示Xpert MTB/RIF檢測的臨床應用價值高于傳統涂片和液體培養法。目前，結核門診就診的具有典型癥狀或體征的肺結核患者明顯減少，影像學表現不典型者亦較多，給臨床醫生的診斷帶來的難度越來越大。Xpert MTB/RIF檢測技術的應用則能更好地輔助臨床醫生進行診斷，尤其對于菌陰肺結核患者進行早期診斷和治療。

本研究結果顯示，以液體培養法結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測涂陽患者和涂陰患者MTB的敏感度分別為96.63%和81.67%，與國內報道的Xpert MTB/RIF檢測涂陽患者敏感度結果相近[4，17]。西班牙[18]、法國[19]和美國[20]分別開展的3項試驗顯示，Xpert MTB/RIF對痰涂片陽性標本的檢測敏感度為98%～100%，對痰涂片陰性標本的檢測敏感度為57%～83%，與本研究結果相近。由此，提示該方法檢測痰涂片陽性標本時的敏感度較高，而檢測痰涂片陰性標本時的敏感度相對較低[20-22]。

本研究中，Xpert MTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥的敏感度為90.00%，特異度為99.07%。與國內外報道的敏感度相近[4，13-14]。但由于本研究的對象為初診的疑似肺結核患者，檢測到對利福平耐藥的患者例數較少，下一步將擴大樣本量進行進一步評估。

綜上，Xpert MTB/RIF是一種快速、簡便、自動化的分子診斷方法，敏感度和特異度較高，相對涂片、液體培養法及傳統藥敏試驗等檢測技術，其對實驗室生物安全要求較低，且對操作人員危害輕，適用于基層實驗室早期診斷結核病及是否對利福平耐藥。WHO建議加快Xpert MTB/RIF檢測技術的推廣，作為一種全新的結核病快速診斷工具在臨床上使用[12，23]。本研究也在某種程度上證明，該方法在我國基層實驗室對于結核病診斷及是否對利福平耐藥的患者篩査具有一定的意義和應用前景。但Xpert MTB/RIF檢測技術需要相應的儀器及配套試劑，價格昂貴，且該方法僅能檢測利福平是否耐藥，而不能夠對異煙肼是否耐藥進行檢測，不能診斷耐多藥結核病，這些都限制了其在我國實驗室診斷中的廣泛應用。

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(本文編輯：李敬文)

Application of GeneXpert MTB/RIF test for early diagnosis of tuberculosis

LULi-ping*,LUBin,LIUMei,HONGJian-jun,GUOXiao-qin,GAOQian.

*DepartmentofTuberculosisControl,SongjiangDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai201620,ChinaCorrespondingauthor:LULi-ping,Email:luluyer-1194@163.com

Objective To evaluate the application of GeneXpert MTB/RIF in detecting tuberculosis and resistance to rifampin. Methods Sputum samples from of 556 continuous patients with suspected tuberculosis from Clinics in Songjiang Central Hospital between January, 2015 and June in, 2015 were collected. The sensitivity and specificity of differentwere detected by smear test, liquid culture, traditional proportion method drug susceptibility test, and GeneXpert MTB/RIF test, the detection rates ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) and rifampin resis-tances of traditional methods and GeneXpert MTB/RIF were analyzed. Results The positive rates of bacteria smear, liquid culture, and GeneXpert MTB/RIF method used for 537 sputum samples were 17.32% (93/537), 28.31% (152/537) and 28.12% (151/537). Compared to the liquid culture result (the golden standard), the sensitivity and specificity of the GeneXpert MTB/RIF for MTB were 90.60% (135/149) and 95.84% (369/385), the sensitivity was significantly higher than that of smear microscopy (60.53% (92/152);χ2=36.71,P<0.01). The sensitivities of GeneXpert MTB/RIF test for sputum smear-positive and smear-negative were significantly different (96.63% (86/89) vs. 81.67% (49/60),χ2=9.43,P<0.01). According to the result of conventional drug susceptibility with proportion method, the sensitivity, specificity and consistent rates of GeneXpert MTB/RIF test in detecting rifampin resistance were 90.00% (9/10), 99.07% (106/107) and 98.29% (115/117), respectively. Conclusion GeneXpert MTB/RIF method is simple, rapid,and with high safety, sensitivity and specificity, therefore, it has great value in the early diagnosis of tuberculosis and determination of rifampin resistance in primary laboratories.

Mycobacteriumtuberculosis; Sputum； Nucleic acid amplification techniques； Early diagnosis; Rifampin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.01.016

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10004903)

201620 上海市松江區疾病預防控制中心結核病防治科(路麗蘋、洪建軍、郭曉芹)；上海市松江區中心醫院檢驗科(陸斌)；復旦大學上海醫學院 教育部、衛生部醫學分子病毒學重點實驗室(劉梅、高謙)

路麗蘋，Email：luluyer-1194@163.com

2016-06-02)