雞減蛋綜合征滅活抗原不同保存方式的分析比較

王嘉，顧慶云，金紅巖，毛婭卿，吳濤，王哲，孔冬妮，李嶺

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2. 西藏職業技術學院，拉薩 850030)

雞減蛋綜合征滅活抗原不同保存方式的分析比較

王嘉1，顧慶云2，金紅巖2，毛婭卿1，吳濤1，王哲1，孔冬妮1，李嶺1

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2. 西藏職業技術學院，拉薩 850030)

為比較不同保存方式對雞減蛋綜合征滅活抗原的影響，采用禽腺病毒京911株(CVCC AV70)經尿囊腔接種易感鴨胚，收獲感染鴨胚液，經β-丙內酯滅活后，對該抗原的保存條件及其穩定性等方面進行優化。凍干抗原與未凍干抗原在相同溫度下，凍干抗原HA效價下降較慢。凍干抗原在2～8 ℃和-15 ℃以下保存，HA效價沒有明顯差異。因此，生產的雞減蛋綜合征滅活抗原要在凍干后保存在2～8 ℃最佳。保存條件的優化不僅可以減少經濟損失，而且還有助于更好的控制禽腺病毒疫情的暴發。

雞減蛋綜合征；禽腺病毒；HA效價；保存方式

雞減蛋綜合征(Egg Drop Syndrome，EDS)是由腺病毒科禽病毒屬第三群具有血凝性的腺病毒引起的一種急性傳染病[1]。其臨床癥狀表現為：產出軟殼蛋、無殼蛋、薄殼蛋等畸形蛋，蛋的破損率明顯增高，整個病程持續5～6周，以后產蛋率逐漸回升，但很難達到下降前水平，嚴重影響養禽業的經濟效益[2-3]。

目前對其預防措施為疫苗免疫，雖然有其他方法進行診斷[4-5]，但其臨床診斷的主要方法是血凝抑制試驗。根據現行《中國獸藥典》三部規定，含EDS部分效力檢驗必須進行血凝抑制試驗[6]。因此，雞減蛋綜合征血凝抑制抗原的研究極具實際意義，易于保存和效價穩定的抗原更具經濟效益。目前使用的抗原存在保存時間短和HA 效價不穩定等問題，本研究對其進行優化，保證臨床診斷的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料 禽腺病毒京911株(CVCC AV70)、雞新城疫陽性血清、雞減蛋綜合征血凝抑制陽性血清購自中國獸醫藥品監察所，置-70 ℃保存；鴨胚購自北京平谷養殖場；β-丙內酯購自Alfa Aesar公司；滅菌生理鹽水、阿氏液、PBS均由中海公司提供；SPF雞紅細胞由中監所基礎保障處提供；禽流感(H5、H7、H9亞型)陽性血清均購自哈爾濱獸醫研究所。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

1.2.1.1 抗原繁殖 將禽腺病毒京911株(CVCC AV70)用滅菌生理鹽水進行10倍稀釋，經尿囊腔接種10～11日齡鴨胚，每胚0.1 mL[7-8]。置37 ℃孵育120 h后，將所有活胚取出，在2～8 ℃條件下冷蛋10 h以上。收獲鴨胚尿囊液，經10000 r/min離心30 min去除雜質。

1.2.1.2 抗原滅活 將收獲的鴨胚尿囊液加入1/4000～1/8000體積的β-丙內酯，置于2～8 ℃滅活10 h以上，再置于37 ℃作用1 h失活。1.2.1.3 分裝及凍干 將滅活后的抗原分為4組，第一組：分裝后-15 ℃以下保存；第二組：加入20%甘油混勻分裝后2～8 ℃保存；第三組：分裝凍干后-15 ℃以下保存；第四組：分裝凍干后2～8 ℃保存。

1.2.2 常規檢驗 將所有抗原按現行《中國獸藥典》[6]進行無菌檢驗、性狀檢驗，應符合現行《中國獸藥典》[6]規定。

1.2.3 效價測定 按現行《中國獸藥典》[6]進行紅細胞凝集試驗，HA效價應不低于1∶512。

1.2.4 保存期試驗 按現行《中國獸藥典》[6]紅細胞凝集試驗方法，將所有抗原分別保存至1個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月檢測其HA效價，以確定其保存時間及溫度。1.2.5 特異性檢驗 將長時間保存HA效價穩定的抗原與雞減蛋綜合征病毒陽性血清、禽流感病毒陽性血清(H5、H7、H9亞型)、新城疫病毒陽性血清以及SPF雞血清按《中國獸藥典》[6]進行血凝抑制試驗。

2 結 果

2.1 無菌檢驗 經25 ℃ TG、GA、GP三種培養基和37 ℃ TG、GA兩種培養基檢測，判定每組抗原均無菌生長，符合現行《中國獸藥典》[6]規定。

2.2 性狀檢驗 結果如表1所示，均符合現行《中國獸藥典》[6]規定。

表1 不同保存條件下抗原性狀檢驗結果

2.3 效價測定 將各組抗原恢復至室溫，凍干抗原恢復至原體積，按現行《中國獸藥典》[6]三部進行紅細胞凝集試驗，每組重復進行三次試驗，HA效價均一致，結果如表2所示。

表2 不同保存條件下抗原HA效價測定結果

2.4 保存期試驗 將每組抗原分別保存至3個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月后，按現行《中國獸藥典》[6]三部進行紅細胞凝集試驗，結果如表3所示。由表中數據可知：未凍干的抗原(第一組、第二組)隨保存時間變長而HA效價變低；凍干毒的抗原(第三組、第四組)盡管保存溫度不同，在保存期內HA效價沒有明顯差異。

表3 不同保存時間HA效價

2.5 特異性檢驗 將保存24個月的凍干抗原(第三組、第四組)與雞減蛋綜合征病毒陽性血清、禽流感病毒陽性血清(H5、H7、H9亞型)、新城疫病毒陽性血清及SPF雞血清按現行《中國獸藥典》[6]進行血凝抑制試驗，結果如表4所示。由表中數據可知，凍干的抗原僅與雞減蛋綜合征病毒陽性血清有血凝抑制反應HI效價為1∶1024，與禽流感病毒陽性血清(H5、H7、H9亞型)、新城疫病毒陽性血清及SPF雞血清HI效價均小于1∶2，判為陰性。

表4 特異性試驗結果

3 討論與小結

雞減蛋綜合征對我國養禽業威脅巨大[9-10]，目前國內外均采用油乳劑滅活疫苗預防本病。其疫苗的效力檢驗要求用本抗原進行，因此對本抗原的穩定性、保存溫度及時間有較高的要求。目前制備工藝未凍干的抗原在2～8 ℃和-15 ℃以下保存均在1～6個月內HA效價下降，盡管未凍干的抗原加入甘油作為保護劑，但在2～8 ℃保存6個月后，HA效價也下降明顯，并影響正常使用。

本研究對現有的雞減蛋綜合征血凝抑制抗原制備工藝進行優化，可以看出凍干的抗原比未凍干的抗原保存時間長，HA效價可長期保持較高的水平。盡管未凍干的抗原加入甘油作為保護劑，但在2～8 ℃保存6個月后，HA效價下降明顯，并影響正常使用。滅活的抗原結凍保存會后使HA效價顯著下降，建議滅活抗原要在2～8 ℃保存。凍干后的抗原在2～8 ℃和-15 ℃以下保存HA效價沒有明顯差異，從運輸、節電等方面考慮，凍干后的滅活抗原在2～8 ℃保存，這不僅可以減少經濟損失，而且還有助于更好的控制禽腺病毒疫情的暴發。

[1] 卡爾尼克 B W. 禽病學[M]. 第9版. 北京:農業大學出版社, 1991.

[2] Su J, Li S, Hu X,etal. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new Tembusu-related flavivirus[J]. PLoS One, 2011, 6(3): e18106.

[3] Cao Z, Zhang C, Liu Y,etal. Tembusu virus in ducks, China[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(10): 1873-1875.

[4] 文艷玲. 禽腺病毒hexon基因克隆表達及間接ELISA和熒光PCR檢測方法的建立[D]. 廣西大學, 2008.

[5] 林洪強, 孫 剛, 潘興廣, 等. 間接法Dot-ELISA檢測雞減蛋綜合癥抗體的建立及應用研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 1997, 10: 3-5.

[6] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[S]. 2010年版三部.[7] 郭慧琳, 賀奮義, 陳伯祥. 雞減蛋綜合癥病毒在鴨胚尿囊液中增殖動態試驗研究[J]. 國外畜牧學(豬與禽), 2010, 2: 76-77.

[8] 張家好, 馬伏泉. 雞減蛋綜合癥病毒在鴨胚中增殖規律的研究[J]. 安徽農業科學, 2001, 01:114.

[9] Liu P, Lu H, Li S,etal. Duck egg drop syndrome virus: an emerging Tembusu-related flavivirus in China[J]. Sci China Life Sci, 2013, 56(8): 701-710.

[10]Chen S, Wang S, Li Z,etal. Isolation and characterization of a Chinese strain of Tembusu virus from Hy-Line Brown layers with acute egg-drop syndrome in Fujian, China [J]. Arch Virol, 2014, 159(5): 1099-1107.

(編輯：李文平)

Analysis and Comparison of Different Preservation Methods of Inactivated Antigen of Chicken Egg Drop Syndrome

WANG Jia1，GU Qing-yun2，JIN Hong-yan2，MAO Ya-qing1，WU Tao1，WANG Zhe1，KONG Dong-ni1，LI Ling1

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 2.TibetVocationalTechnicalCollege,Lhasa850030,China)

In order to compare the effects of different preservation methods on the inactivated antigen of chicken egg drop syndrome, avian adenovirus Beijing 911 strain (CVCC AV70) was inoculated in duck embryo allantoic cavity. Optimizing the preservation conditions and stability of antigen after the harvested virus was inactivated by β propiolactone. Comparison of the freeze dried antigen and the non freeze dried antigen at the same temperature, the titer of freeze-dried antigen HA decreased slowly, and there was no significant difference in HA titer at different temperatures. Therefore, the freeze dried and inactivated antigen of the chicken egg drop syndrome should be kept at 2～8 ℃. Optimization of preservation conditions can not only reduce economic losses, but also contribute to a better control of the outbreak of avian adenovirus.

egg drop syndrome; avian adenovirus; HA titer; preservation method

王嘉，助理研究員，從事獸用生物制品檢驗工作。E-mail: 44613623@qq.com

2016-10-17

A

1002-1280 (2017) 01-0012-03

S858.31