低溫保存對Hep?G2細胞凋亡的影響

梁瑋 姚嵐 劉寶林

（上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093）

低溫保存對Hep?G2細胞凋亡的影響

梁瑋 姚嵐 劉寶林

（上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093）

樣本質量是體現生物樣本庫價值的關鍵，但是低溫保存可能導致細胞凋亡及基因表達量的變化，影響樣本質量。本文采用流式細胞術與實時熒光定量PCR（qPCR）的方法，研究了Hep?G2細胞在不同條件下凍存后凋亡及相關基因表達量。結果表明：低溫保存影響Hep?G2細胞的成活率、凋亡情況及某些凋亡基因表達量。無論凍存過程中是否添加低溫保護劑，低溫保存都會對細胞的凋亡相關基因表達帶來不同程度的影響。不添加保護劑凍存會導致細胞死亡，添加10%DMSO凍存會導致細胞凋亡，復蘇培養24 h后細胞的成活率、凋亡情況與相關基因表達量基本與對照組水平一致。

低溫保存；細胞凋亡；流式細胞術；實時熒光定量PCR

表1實驗設計Tab.1 Design of the experiment

1 實驗材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1材料與試劑

Hep?G2細胞（中科院上海生命科學研究院），胎牛血清，DMEM培養基，臺盼藍染色液（2X），二甲亞砜（DMSO），Annexin V?FITC細胞凋亡檢測試劑盒，RNAiso Plus，反轉錄試劑盒PrimeScriptRRT reagent Kit，實時熒光定量 PCR試劑盒 SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time），Sample Protector for RNA／DNA。

1.1.2儀器與設備

HH.CP?01W 細胞培養箱，低速臺式離心機，FACS CaliburTM流式細胞儀，7900HT實時熒光定量PCR儀。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組

表1所示為實驗分組及各組的凍存液選用、凍存條件等情況。實驗所用細胞均取于同一批次培養后的細胞，凍結并復溫后，立即用離心法收集細胞，用于后續檢測。

1.2.2細胞培養及凍存

Hep?G2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養，細胞培養箱條件為 5%CO2、飽和濕度、37℃，細胞覆蓋率達到90%時傳代，傳代4～5次后取處于對數生長期的細胞用于實驗。細胞收集后加入冷凍保護液重懸，4℃平衡5 min后，以1℃／min的速度降溫至 －80℃，穩定4 h后長期儲存在－80℃冰箱或液氮中。

1.2.3細胞成活率［6］

取重懸細胞100 μL于1.5 mL離心管中，再加入100 μL臺盼藍染液染色，混勻后靜止3～5 min，吸取10 μL于血球計數板計數，分別記錄活細胞和死細胞數量。按公式（1）計算細胞存活率，每組實驗均重復三次。

1.2.4細胞凋亡檢測

收集各組細胞，D?hank′s重懸，按照Annexin V?FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明進行染色，然后上機測定。

1.2.5 qPCR檢測［7］

細胞收集后加入Sample Protector for RNA／DNA，于－20℃保存。用 RNAiso Plus提取各實驗組的RNA，然后參照反轉錄試劑盒的說明書除去其中混有的DNA，隨后以去除了DNA的RNA為模板，做反轉錄，制備出單鏈cDNA，保存于－20℃。

表2細胞凋亡相關基因引物序列Tab.2 The primer sequences of apoptosis?related genes

根據Genebank檢索凋亡相關基因，選取Bcl?2，Fas，Caspase?8為研究對象，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（見表2），引物長度20～0 bp，擴增的產物在100～200 bp左右，所有引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

以Actin為內參基因，按照實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）的說明書配置PCR反應液20 uL，并振蕩搖勻，使其充分混合。隨后放入PCR儀器中，設置首先在50℃作用2 min、95℃作用2 min，然后95℃作用15 s、53℃作用20 s、72℃作用20 s，重復40個循環，最后95℃作用2 min終止反應。用2－ΔΔC（t）方法對qPCR結果進行分析，其中正常對照組的結果均為1，所有實驗均重復3次。

1.2.6統計分析

采用統計分析軟件SPSS11.0對細胞成活率數據及qPCR數據進行配對t檢驗，各處理組與正常對照組進行比較，P＜0.05即認為差異顯著，P＜0.01認為差異非常顯著。

2 實驗結果

2.1 成活率

臺盼藍染色計算成活率的結果如圖1所示，實驗2和實驗3組細胞凍存時未添加保護劑，全部死亡，實驗4組添加DMSO后在常溫下放置30 min也會造成一部分細胞死亡，經過凍存后，細胞成活率均有所下降，并且－80℃凍存9 d的成活率（實驗5組）比液氮中凍存30 d（實驗6組）成活率低。復蘇培養24 h后（實驗7組）成活率又恢復至對照組水平。

圖1 Hep?G2的成活率Fig.1 The survival rate of Hep?G2

2.2 細胞凋亡結果

流式細胞儀檢測細胞凋亡率的結果如圖2所示，各個時期細胞占比見表3。對照組有94.32%的細胞為正常細胞，實驗2和實驗3組細胞全部死亡，幾乎檢測不到正常大小的細胞，超大細胞及碎片率分別達到99.87%及97.14%，其各個時期細胞所占百分比并無實際意義。實驗4組細胞在DMSO保護液中室溫放置30 min后，凋亡早期細胞由2.34%增加到27.83%。冷凍后凋亡早期細胞減少，而凋亡晚期和壞死的細胞增多。但是在液氮中冷凍保存的細胞正常細胞所占比率更高一些。實驗7組細胞復蘇后培養24 h細胞凋亡率明顯降低，達到對照組的水平。

圖2流式細胞儀檢測凍存前后細胞凋亡率的結果（（a）～（g）分別為實驗1～7組細胞檢測結果。右上象限為凋亡晚期及壞死細胞，右下象限為凋亡早期細胞，左下象限為正常細胞）Fig.2 The apoptosis of cells before and after cryopreservation（The results of No.1?7 are shown from a to g respectively，the upper right，lower right and lower left quadrants indicate the late?stage apoptotic and necrotic cells，early?stage apoptotic cells and the normal cells respectively）

表3 凍存前后細胞凋亡情況Tab.3 The apoptosis of cells in different stage before and after cryopreservation

2.3 qPCR檢測結果

如表4所示，實驗2和實驗3組細胞不添加任何保護劑凍存，抑制凋亡的基因Bcl?2表達量沒有顯著變化，而促進凋亡的基因Caspase?8與Fas在－80℃凍存9 d后表達量略有下降，液氮凍存30 d后表達量顯著增加。

表4 qPCR檢測Hep?G2細胞目的基因的2－ΔΔC（t）值（±s，n＝3）Tab.4 2－ΔΔC（t）value of the genes in Hep?G2 by qPCR（±s，n＝3）

表4 qPCR檢測Hep?G2細胞目的基因的2－ΔΔC（t）值（±s，n＝3）Tab.4 2－ΔΔC（t）value of the genes in Hep?G2 by qPCR（±s，n＝3）

注：?：P＜0.05，??：P＜0.01，n＝3。

編號 Bcl?2 Fas Caspase?8 1 1.01±0.20 1.01±0.16 1.03±0.32 2 0.60±0.11?0.38±0.25?0.92±0.33 3 0.76±0.10 1.98±0.12??2.83±0.14??4 2.50±0.05??0.36±0.07??1.13±0.39 5 1.85±0.22??0.52±0.01??0.90±0.12 6 0.32±0.09??0.60±0.03?0.41±0.09?7 0.95±0.11 0.55±0.02??0.95±0.11

實驗4組細胞在室溫下DMSO處理30 min，Bcl?2表達量增加。實驗5組細胞－80℃凍存9 d后Bcl?2依舊保持較高的表達量。實驗6組細胞在液氮凍存30 d后Bcl?2、Caspase?8與Fas表達量有顯著降低。復蘇后培養24 h表達量有所恢復。

3 討論

細胞凋亡是醫學基礎研究的重要內容。生物樣本庫低溫保存的樣本主要服務于轉化醫學研究，用于新藥開發的實驗，這需要在樣本保存后不發生凋亡特性的改變，并且凋亡相關的基因表達水平也不能發生改變。添加冷凍保護劑保存樣本可以使凍存的樣本具有活性，應用于樣本擴大化或PDX模型的建立。細胞凋亡也是器官組織深低溫保存后喪失功能的重要原因［8］。因此研究冷凍對細胞凋亡的影響具有重要意義。本文以Hep?G2細胞為模型，對低溫保存后細胞的成活率、凋亡率及幾個凋亡相關基因表達量三個方面進行了研究。

3.1 細胞成活率、凋亡率及凋亡相關基因表達量之間的關系

實驗中得到的細胞的成活率與細胞凋亡的結果一致。用臺盼藍染色法測定細胞成活率時，正常細胞及凋亡早期細胞均檢測為活細胞，而凋亡晚期及壞死細胞則檢測為死細胞。不加保護劑凍存后的細胞全部死亡，成為細胞碎片，在流式細胞儀上檢測為非正常大小細胞，不會被計入有效細胞進行凋亡統計。因此，檢測細胞凋亡是一項更準確判斷細胞狀態的方法。在進行組織器官保存研究時，要盡可能采取檢測細胞凋亡的方法對保存效果進行判斷。

實驗6組（75.92%）比實驗4組（65.94%）正常細胞的比例高，這是因為DMSO的毒性隨著溫度和時間的增加而增加［9］。實驗4組在室溫暴露于DM?SO溶液30 min，而實驗6組僅僅在4℃平衡5 min后就開始程序降溫，因此實驗6組中DMSO的毒性帶來的損傷更小，凋亡細胞的比例也小一些。

現階段生物樣本庫保存的樣本主要用于提取生物大分子（DNA、RNA和蛋白質等），此時保存的目標是凋亡基因表達量不發生改變，并不需要保證樣本存活，本文的研究也說明細胞凋亡基因表達量的變化與成活率沒有明顯的聯系。

3.2 細胞凋亡機制及相關基因表達量的變化

關于冷凍后細胞發生凋亡機制的研究已有很多，J.M.Baust等［10］和U.Rauen等［11］的研究結果發現，細胞在冷凍過程中受到外界環境的刺激，如氧化應激反應，滲透壓損傷、冰晶形成、Na＋／K＋?ATP酶抑制使離子內環境紊亂等，均會發生凋亡，此時細胞內發生一系列的級聯反應，導致細胞凋亡相關的酶活化，促使細胞發生凋亡反應。本實驗還對凋亡過程中若干關鍵的基因表達水平進行了研究，為抑制冷凍保存過程中凋亡發生的研究提供參考。

Caspase?8主要出現在凋亡的早期，是細胞凋亡的啟動者，有研究表明冷凍損傷造成的凋亡是由Caspase死亡受體依賴的線粒體途徑介導，而不涉及非Caspase蛋白酶［12?13］。Fas是誘導多種細胞凋亡的最主要的死亡受體之一，在Fas誘導的細胞凋亡體系中，Fas通過激活 Caspase?8傳導凋亡信號［14?15］。不加任何保護劑凍存時，細胞在降溫過程中承受冷凍刺激帶來的冰晶與滲透壓損傷，自身會發生調節作用，此時一些基因表達量也可能發生變化。如Caspase?8 與Fas在液氮中凍存30 d后表達量都顯著增高，這說明細胞在無保護劑凍存時，雖然細胞全部死亡，但是在這個過程中也發生了細胞凋亡。而DMSO雖然本身具有一定的毒性，但是卻可以抑制Caspase?8的表達，本實驗與丁麗等［16］的研究都證明了這個結果。

Bcl?2是目前研究較多的凋亡抑制基因［17］，研究表明：Bcl?2通過抑制細胞色素 C的釋放，阻斷Caspase的激活來抑制凋亡，同時Bcl?2表達產物可阻止許多刺激物誘發的細胞凋亡［18］。DMSO能夠誘導凋亡的發生［19－20］，常溫下細胞受到DMSO刺激，Bcl?2過量表達，原因可能是細胞的自我保護機制抑制了凋亡的發生。但是在凍存過程中，DMSO不僅可以保護細胞免于冰晶與滲透壓的損傷，提高細胞的存活率，其對細胞的刺激作用也有所減小，這點可以從Bcl?2的表達量在凍存后有所降低體現。

3.3 復蘇及再培養對細胞凋亡的影響

－80℃冰箱與液氮罐是樣本庫保存樣本常用的兩種保存條件，一般認為在液氮中樣本能得到更好的保存［21］，因為此時細胞的生命活動幾乎完全停止，可以長久保存并且不會引起基因蛋白等表達量的變化。但是細胞在降溫與儲存過程中通常可以保存完好，卻極可能在復溫過程中遭受損傷而死亡［22］。復溫時活細胞會再次經歷滲透壓的變化，胞內冰也可能發生重結晶。這些物理因素的改變也極有可能再次導致某些基因表達量的變化，因此凍存與復溫過程共同影響著凋亡基因的表達。由于技術條件限制，本實驗無法在細胞復溫前的冷凍狀態檢測其成活率、凋亡情況和基因表達水平，因此也無法判斷這些損傷是在哪個階段造成的。但是從應用的角度講，復溫是必經過程，研究復溫后的細胞凋亡情況也具有實際意義。關于如何減少冷凍保存帶來的細胞凋亡，C.Stroch等［23］的研究表明，無論在冷凍還是復溫過程中加入Caspase抑制劑，都可以阻止Caspase的激活，提高冷凍后細胞的復蘇率。

凍存是目前保存細胞與組織常用的方法，但是細胞在冷凍及復蘇過程中會發生一些變化，那么再培養就是細胞恢復正常所必經的過程，細胞進行自我修復和生長，可達到最佳生長狀態。但是復蘇培養24 h 后Fas基因表達量依然很低，這可能是因為不同基因表達量的恢復時間不同，可延長培養時間進一步觀察。然而復蘇培養后的細胞已與凍存前的細胞完全不同，其基因表達水平是否能真正代表凍存前的狀態，復蘇培養技術能否應用于生物樣本庫還需要斟酌。因此目前可行的辦法是通過添加凋亡抑制劑或改進保護劑配方以穩定RNA的表達。

4 結論

本文通過用流式細胞術與實時熒光定量PCR對Hep?G2細胞進行凋亡情況的研究，得到如下結論：

1）無論凍存過程中是否添加低溫保護劑，低溫保存都會對細胞的凋亡相關基因表達帶來不同程度的影響。

2）不加保護劑凍存會導致細胞死亡，添加10% DMSO凍存會導致細胞凋亡，復蘇培養24 h后細胞的成活率和凋亡情況與相關基因表達量基本與對照組水平一致。

3）本文僅對一種細胞凍存后的凋亡情況和幾個凋亡相關基因表達量進行了研究，還有許多凋亡通路中的相關基因需要進一步研究。

4）實驗中所選的保護劑DMSO會對細胞凋亡帶來較大影響，可通過添加凋亡抑制劑或更換保護劑以減少細胞凋亡，穩定凋亡相關基因表達。

本文受上海東方學者跟蹤計劃項目資助。（The project was supported by the Project Tracing Program of Oriental Schol?ars.）

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Effects of Cryopreservation on Apoptosis in Hep?G2 Cells

Liang Wei Yao Lan Liu Baolin

（Institute of Biothermal and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China）

The quality of biospecimens is a very important factor of evaluating a biobank.Cryopreservation may induce apoptosis and changes of gene expression in cells.In this research the apoptosis profiles were assessed by flow cytometry and the expression of RNAs re?lated to apoptosis were estimated by real?time fluorescent quantitative PCR（qPCR）in Hep?G2 cells after cryopreservation.The results showed that with the addition of 10%DMSO or no cryoprotectant during cryopreservation，the cryopreservation progress made some impact on apoptosis and the expression of RNAs related to apoptosis in Hep?G2 cells.During cryopreservation，the cells were all dead with no cryoprotectant，but more cells apoptosis occurred with 10%DMSO.The cells could be recovered to normal level when the cells were re?cultured for 24 hours after cryopreservation.

cryopreservation；apoptosis；flow cytometry；real?time fluorescent quantitative PCR

TB61＋1；R318.52；R73?3

A

0253－4339（2017）01－0113－06

10.3969／j.issn.0253－4339.2017.01.113

2016年4月29日研究了其在不同條件下凍存前后的凋亡情況及其幾 個凋亡相關基因凍存前后表達量的變化。

國家自然科學基金（51076108）資助項目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51076108）.）

生物樣本庫（biobank）也叫生物銀行，是指標準化收集、處理、儲存和應用健康和疾病生物體的生物大分子、細胞、組織和器官等樣本（包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經處理過的生物樣本（DNA、RNA、蛋白等）以及與這些生物樣本相關的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質量控制、信息管理與應用系統［1］。生物樣本庫是轉化醫學研究的戰略資源［2］，一個高質量的生物樣本庫不僅要有種類豐富的大量樣本，更重要的是能夠保證這些樣本的質量［3］。基于生物樣本庫的研究都要以其中保存樣本的質量未發生改變為前提，只有徹底排除在保存過程中發生的基因、蛋白質等變化，才能準確判斷患病前后或治療前后基因表達之間真正的關聯［4］。因此為了研究結果的可靠性，需要迫切了解在低溫保存過程中樣本質量是否發生改變。目前已有學者針對樣本庫中保存樣本的RNA質量進行了研究［5］，但是少有對比樣本凍存前后質量變化的結果。此外，對細胞在不同凍存條件下凍存前后RNA質量的變化進行研究，也可以為改進組織和血液的凍存方法提供參考。

凋亡是腫瘤基礎研究中非常重要的特性，Bcl?2、Fas、Caspase?8是研究細胞凋亡的重要基因，由于組織的結構和成分比較復雜，一般在研究前先選取簡易的細胞系模型進行初步研究。肝癌是一種常見的腫瘤疾病，很多樣本庫都保存有肝癌樣本。因此本文選取了常用的細胞模型——人肝癌上皮細胞Hep?G2，

劉寶林，男，教授，博士，上海理工大學醫療器械與食品學院，（021）55277768，E?mail：blliuk＠163.com。研究方向：生物材料的低溫保存。

About the corresponding author

Liu Baolin，male，Ph.D.／professor，School of Medical Instru?ment and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 21?55277768，E?mail：blliuk＠163.com. Research fields：cryopreservation of biomaterials.