體外高糖環境對H9c2心肌細胞中STIM1、Orai1及TRPC1的影響

陳夢楠 盧海龍 李雷 楊榮禮

體外高糖環境對H9c2心肌細胞中STIM1、Orai1及TRPC1的影響

陳夢楠 盧海龍 李雷 楊榮禮

目的 構建體外高糖誘導的心肌損傷模型,觀察體外高糖環境對H9c2心肌細胞的增殖以及基質作用分子1(STIM1)、Orai1和瞬時受體電位通道1(TRPC1)表達的影響。 方法 體外培養鼠胚H9c2心肌細胞,隨機分為4組,正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲組(27.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(33 mmol/L葡萄糖),藥物組(2 μmol/L SKF96365+33 mmol/L葡萄糖)。培養72 h。采用CCK8技術檢測細胞增殖率;采用RT-PCR以及Western blotting技術測定4組STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA和蛋白表達水平的變化。 結果 正常對照組和高滲組STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相對表達量差異無統計學意義(P均>0.05);高糖組STIM1、Orai1及TRPC1的mRNA及蛋白相對表達量較正常對照組增加(P均<0.05);藥物組的表達量較正常對照組高(P均<0.05),較高糖組下降(P均<0.05)。 結論 體外高糖在一定程度上抑制心肌細胞增殖,促進STIM1、Orai1及TRPC1蛋白的表達,這可能是體外高糖環境下H9c2心肌細胞損傷的機制之一。

糖尿病心肌病; 高糖; 基質作用分子1; Orai1; 瞬時受體電位通道1

糖尿病已經成為影響全球的重大公共健康問題,據美國疾控中心數據表明,全球糖尿病病人已達到2.4億人,預計至2030年患病人數將達到4.39億[1]。我國已成為世界上糖尿病患病人數最多的國家[2-3]。作為糖尿病最常見的心血管并發癥之一的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM),已成為1型或2型糖尿病病人死亡的主要因素。迄今為止,DCM的發病機制仍不明確,并且治療未有實質性突破。研究發現DCM的發生與細胞內鈣超載有關[4],鈣庫操縱性鈣通道(store-operated channels, SOCs)主要由基質交感分子 (stromal interaction molecule, STIM)1、Orai1、經典瞬時受體電位通道1(transient receptor potential canonical 1, TRPC 1)3種蛋白組成,是細胞外鈣離子進入的主要途徑之一。高血糖毒性是損害心臟及血管的主要因素,對于高血糖對心肌細胞內鈣超載是否有促進作用以及其可能機制的相關文獻報道較少。本研究以體外培養的鼠胚心肌細胞H9c2為研究對象,觀察體外高糖對細胞形態及增殖的影響,選用鈣庫操縱性鈣內流(store-operated ca2+entry, SOCE)通道非特異性阻滯劑SKF96365,抑制SOCE,探討DCM的可能機制,以期為臨床DCM的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 鼠胚心肌細胞H9c2購自中國科學院上海生命科學研究院。胎牛血清(FBS)(中國四季青公司),DMEM培養基(美國HyClone公司),D-葡萄糖(美國Gibco公司),細胞計數盒CCK-8(日本同仁公司),細胞總RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒、RNA marker(上海生物工程有限公司),STIM1、Orai1、TRPC1以及β-Actin引物(中國金唯智公司),PCR試劑(中國Vicmed公司),STIM1(66189-1-Ig)、Orai1(13130-1-AP)及TRPC1(19482-1-AP)一抗(美國proteintech公司),SDS-PAGE凝膠配置試劑、BCA試劑盒(上海碧云天公司),SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

1.2 細胞培養及分組處理 用含有10% FBS的低糖(5.5 mmol/L)DMEM培養基培養H9c2細胞。至細胞鋪滿85%左右培養面積后,0.25%胰酶消化,1:2傳代,8～9代細胞用于實驗。待細胞至對數生長期后,以相應的細胞密度,分別接種于96孔板、6孔板及培養皿中,培養24 h;待細胞生長至融合狀態后,換為無血清低糖DMEM培養基,繼續培養24 h,使細胞成靜止狀態后隨機分成相應組別。

1.3 心肌細胞存活率檢測 接種于96孔板的細胞隨機分為5組,其中葡萄糖濃度依次為5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、33 mmol/L、44 mmol/L,分別于培養1 d、2 d、3 d和4 d后每孔加入10 μl的 CCK-8和90 μl的DMEM,在37 ℃、5%CO2條件下孵育1 h,酶標儀(λ=450 nm)檢測吸光度(A)值,計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(處理組A值-空白孔A值)/(對照組A值-空白孔A值)×100%,每組設3個復孔,實驗重復3次。以未加細胞懸液的DMEM培養液為空白孔,5.5 mmol/L葡萄糖組為對照組。對照組心肌細胞存活率定義為100%。結果提示在33 mmol/L葡萄糖作用3 d后,細胞存活率僅為(51.67±4.73)%,顯著下降,在超過此濃度及時間條件下細胞存活率極低,因此選用33 mmol/L的濃度和3 d時間作為高糖誘導心肌細胞損傷模型的條件。見表1，圖1。

依據上述實驗結果分組為:正常對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲組(27.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(33 mmol/L葡萄糖),藥物組(2 μmol/L SKF96365+33 mmol/L葡萄糖)(阻滯劑濃度由前期實驗結果確定)。

表1 不同濃度葡萄糖處理不同時間細胞增值率比較,%, n=3)

注:各組間比較,P均<0.05

圖1 不同濃度葡萄糖處理不同時間對H9c2心肌細胞的影響(n=3,P均<0.05)

1.4RT-PCR檢測心肌細胞mRNA的表達 接種于6孔板的正常對照組、高滲組、高糖組、藥物組細胞于3d時提取細胞總RNA(由上步實驗結果確定葡萄糖濃度和時間點),并測定RNA濃度并配平。按照反轉錄試劑盒進行cDNA的合成。STIM1引物序列:上游:5’-TCTGAAGAGTCTACCGAAGC-3’,下游:5’-AGGTCCTCCACGCTGATA-3’;Orai1引物序列:上游:5’-GCCAGAGTTACTCCGAGGTGA-3’,下游:5’-ATGAGGGCGAACAGGTGC-3’;TRPC1引物序列:上游:5’-GCTGTGGTATGAAGGGTT-3’,下游:5’-AAGAAGAGCCGAAGGTAA-3’。PCR反應條件:94 ℃預變性5min、94 ℃變性30s、55 ℃退火30s、72 ℃延伸30s、72 ℃徹底延伸7min,基因擴增循環次數分別為:β-actin24個、STIM1和TRPC1 33個、Orai1 28個。待擴增之后進行瓊脂糖凝膠電泳,SyngeneG:BOX凝膠成像系統采集圖像,采用ImageJ軟件進行灰度分析。以β-actin(上游:5’-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3’,下游5’-TGCCACAGGATTCCATACC-3’)為內參照。實驗重復3次。

1.5Westernblotting檢測心肌細胞中蛋白的表達 接種于培養皿中的正常對照組、高滲組、高糖組、藥物組細胞于3d時提取細胞總蛋白,檢測濃度后配平,采用Westernblotting技術檢測STIM1(1∶1000)、Orai1(1∶1000)及TRPC1(1∶1000)蛋白的表達水平。詳細步驟參照試劑盒說明書。以β-actin(66009-1-Ig,美國proteintech公司)為內參照。采用ImageJ軟件進行灰度分析。實驗重復3次。

2 結果

2.1 各組心肌細胞mRNA相對表達量比較 在培養至3 d后,正常對照組和高滲組STIM1、Orai1、TRPC1的mRNA相對表達量的差異沒有統計學意義(P均>0.05)。高糖組STIM1、Orai1、TRPC1的mRNA相對表達量較正常對照組均增加(P均<0.05),加入阻滯劑后其表達量較高糖組下降,但尚未達到正常水平(P均<0.05);見圖2、圖3。

圖2 各組mRNA表達結果

注:以β-actin為內參照;與正常對照組比較, *P<0.05;與高糖組相比,P<0.05圖3 各組mRNA相對表達水平

2.2 各組心肌細胞蛋白相對表達量比較 在培養3 d后,正常對照組和高滲組STIM1、Orai1、TRPC1的蛋白相對表達量的差異沒有統計學意義(P均>0.05)。高糖組STIM1、Orai1、TRPC1的蛋白相對表達量較正常對照組增加(P均<0.05),加入阻滯劑后其表達量較高糖組下降,但尚未達到正常水平(P均<0.05);見圖4、圖5。

圖4 各組蛋白表達結果

注:以β-actin為內參照;與正常對照組比較, *P<0.05;與高糖組比較,△P<0.05圖5 各組蛋白相對表達水平

3 討論

在糖尿病心肌損傷中，高血糖為獨立的危險因素,并且DCM的發生發展與高血糖的水平及持續時間密切相關[5]。DCM的機制可能與晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)堆積、Ca2+攝取功能的改變、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產生增多及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的激活等機制密切相關,并且具有互相關聯、相互調節的作用[6]。雖有眾多研究者對DCM的機制進行了大量的研究,但目前糖尿病的心肌功能障礙和高糖誘導心肌損傷的確切機制尚不明確,高血糖誘導的心肌損傷尚未尋找到有效的防治措施。

目前認為SOCE主要激活方式為:G蛋白偶聯受體(GPCR)接受細胞外的刺激信號,活化磷脂酶C(phospholipase C, PLC)并分解4,5-二磷酸脂酰肌醇(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)產生二酰甘油(diacylgycerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)。其中IP3作為一種重要的效應蛋白與內質網/肌漿網(ER/SR)上的IP3受體結合并介導受體開放,胞內鈣池快速耗竭。位于ER/SR上的以相對寡聚體形式存在的STIM1接受到鈣庫中Ca2+濃度降低時,STIM1構象發生變化進一步導致其發生寡聚,進而易位到近細胞膜的區域聚集形成斑塊。然后位于細胞膜上的Orai1和TRPC1與聚集的STIM1多聚體相互作用,激活Orai1和TRPC1通道,產生對Ca2+有高度選擇性的SOCE通路形成Ca2+內流[7-11]。它通過對Ca2+內流的調控產生生物學效應,近些年研究表明,細胞內鈣穩態失調是誘發心血管疾病的重要因素[12-13]。

研究者們逐漸發現,SOCE對葡萄糖水平的變化較敏感。1995年Rivera等[14]研究指出,在平滑肌細胞中高血糖可抑制SOCE的過程。Estrada等[15]同樣發現,糖尿病小鼠的血管內皮細胞中ER鈣水平降低，并且STIM1蛋白表達水平顯著降低,過表達STIM1可恢復ER鈣水平并且可以改善糖尿病冠狀動脈內皮依賴性的舒張效應。他們隨后的研究發現,將正常的離體血管內皮細胞暴露于高血糖的狀態下,亦會發生ER鈣水平和STIM1水平的變化。但有研究結果恰恰與之相反,其發現在血管內皮細胞中高糖可通過上調STIM1、Orai1來增強SOCE[16]。近些年有研究表明,心肌細胞內鈣超載與糖尿病心肌病的發生有關。另有研究發現在H9c2心肌細胞系中,高糖可促進心肌細胞 TRPC6表達,導致TRPC通道開放,進一步引起心肌細胞內鈣超載[17]。而目前在心肌細胞中高糖對SOCE的影響尚不清楚,尚需要進一步研究。

本研究顯示,在葡萄糖濃度越高及時間越久的狀態下,細胞存活力逐漸降低,表明高糖對心肌細胞的損傷有著明顯的濃度和時間依賴性。在33 mmol/L葡萄糖濃度3 d條件下,細胞出現明顯的肥大、變性、凋亡,并且增殖率顯著降低,因此選用此濃度作為高糖誘導心肌細胞損傷的實驗條件。實驗中高滲組的對照排除了滲透壓對實驗的影響。緊接著本實驗通過RT-PCR及Western blotting技術,對心肌細胞中Ca2+內流的主要通道SOCs進行檢測,結果表明在高糖組STIM1、Orai1、TRPC1的mRNA及蛋白的表達水平均顯著增加,藥物組表達顯著下降。其可能原因為:細胞內Ca2+濃度的增加可激活鈣調神經磷酸酶-活化T細胞核因子 (nuclear factor activated T cells,NFAT)信號通路、鈣調素依賴蛋白激酶(CaMK)-組蛋白脫乙酰酶(HDAC)信號通路使胚胎基因表達增加,從而介導SOCs表達增加。SKF96365是SOCE通路的非特異性阻滯劑,可減少細胞外Ca2+內流,從而減輕細胞內鈣超載,由細胞內Ca2+激活的胚胎基因表達減弱。該結果提示體外高糖誘導的H9c2心肌損傷中有SOCE的參與,其可能為糖尿病心肌病的機制之一。

綜上所述,本實驗初步觀察到體外高糖環境可抑制H9c2心肌細胞增殖,促進STIM1、Orai1及TRPC1的表達,提示體外高糖誘導的H9c2心肌損傷中有 SOCE的參與,這可能是體外高糖H9c2心肌細胞損傷的機制之一。本研究為DCM可能的發病機制及治療提供了新線索。

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Effects of high glucose on the STIM1，Orai1 and TRPC1 in H9c2 cardiomyocyte in vitro

CHENMeng-nan.GraduateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221004,China;LUHai-long,LILei,YANGRong-li.

DepartmentofGeriatrics,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China

Objective To construct model of myocardial injury induced by high glucose in vitro, and to observe the proliferation of cardiomyocytes and the expressions of STIM1, Orai1 and TRPC1 in H9c2 cardiomyocyte. Methods Mouse embryo H9c2 cardiomyocytes in vitro were cultured, and randomly divided into four groups according to culturing media: normal control group (5.5 mmol/L glucose), hypertonic group (27.5 mmol/L mannite+5.5 mmol/L glucose), high glucose group (33 mmol/L glucose), and drug group (2 μmol/L SKF96365+33 mmol/L glucose). Then the cardiomyocytes were cultured for three days. The cell viability was detected through CCK8 technique. The changes of mRNA and protein expression levels of stromal interaction molecule 1(STIM1)，Orai1 and transient receptor potential canonical 1(TRPC1) in four groups were detected by RT-PCR and Western blotting technique. Results There were no statistical differences in all observed indexes between the normal control group and hypertonic group(P>0.05). The expression of mRNA and protein of STIM1, Orai1 and TRPC1 in high glucose group were higher than those of normal control group (P<0.05); And the relative expression of STIM1, Orai1 and TRPC1 in drug group were lower than those of high glucose group (P<0.05),but higher than those of normal control group(P<0.05). Conclusions High glucose could inhibit the proliferation of H9c2 myocardial cell in vitro and promote the expression of STIM1, Orai1 and TRPC1, and then mediate the entrance of calcium ions. It may be the mechanisms which result in cell damage.

diabetic cardiomyopathy; high glucose; stromal interaction molecule 1;orai1; transient receptor potential canonica 1

徐州市科技計劃項目(KC14SH110)

221004江蘇省徐州市，徐州醫科大學研究生學院(陳夢楠)；221002江蘇省徐州市，徐州醫科大學附屬醫院老年醫學科(盧海龍 ，李雷，楊榮禮)

楊榮禮，Email:yrl6502@sina.com.

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.01.007

2016-02-24)