富集優勢基因型的后備親本篩選以及相關分子標記的遺傳效應分析

張成鋒蘇勝彥朱 健石連玉

(1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部淡水漁業與種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081; 2. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所, 農業部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室, 哈爾濱 150070)

富集優勢基因型的后備親本篩選以及相關分子標記的遺傳效應分析

張成鋒1蘇勝彥1朱 健1石連玉2

(1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部淡水漁業與種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081; 2. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所, 農業部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室, 哈爾濱 150070)

選取黃河鯉新品系親本和子代共450尾, 5對微衛星引物和4個基因區段擴增引物開展基因型檢測, 并檢測它們與體重的關聯性以及分析相應的遺傳效應。結果顯示: Koi42和4個SNPs位點對體重有顯著的影響, 獲得具有超過富集2個優勢基因型的候選親本共13尾, 富集優勢分子標記基因型的候選親本生長性能優勢明顯。通過多元逐步回歸分析, 利用AIC最佳模型篩選到COⅠ626、D-Loop253和Koi42共3個位點, 發現Koi42貢獻率較大, 經Fisher精確性檢驗, 發現其與性別存在關聯, 其加性效應接近顯著水平(P＜0.05)。檢測的多個上位效應組分中, 僅有D-Loop253和Koi42的加性效應間的互作達到顯著水平。對遺傳方差組分進行剖分發現, 加性方差占11.4%, 兩個位點的加性效應構成的上位效應占到77.5%, 因此這3個分子標記對體重的影響主要以上位效應為主, 而且是兩兩加性效應的占比較大, 可以推斷出D-Loop 253和Koi42兩個分子標記的上位效應起主要作用。綜上所述結果提示Koi42及與其有互作的D-Loop253可用于黃河鯉新品系的標記輔助選擇,可以開展多個分子標記的富集選擇。

黃河鯉新品系; 基因型; 體重; 關聯分析; 上位效應

鯉產業在我國水產養殖乃至世界淡水養殖中均占據舉足輕重的地位, 因而運用現代育種技術提升我們鯉產業的科技水平, 發展鯉種業具有重要的意義, 這也是國家發展現代農業和農業產業升級的內在要求。分子標記輔助育種、分子育種、基因組育種、基因組關聯選擇、GBLUP (Genomic best linear unbiased prediction, GBLUP)選育等成為現代育種的重要內容和主要手段(Jonas and de Koning)[1]。目前, 在鯉育種方面主要還是基于數量遺傳學的BLUP (Best linear unbiased prediction, BLUP)育種、分子輔助育種、分子育種。Vandeputte等[2]通過分子標記和全因子交叉設計, 成功的進行了基于分子標記的鯉配對繁殖技術, 并估計了體重和體長的遺傳力, 均為0.33, 他們主要采用的是選育原始代親本, 然后再從它們的后代中增加留選親本的思路。使用同樣的方法, Kocour等[3]在鯉加工和肉質性狀上同樣進行了以分子育種為基礎的遺傳力估計。隨后, Vandeputte等[4]不僅估計了鯉實際分子育種的遺傳力, 還對選擇反應作出評估: 配對方式采用全因子交叉設計, 體重的遺傳力范圍為0.31—0.44, 體長的遺傳力范圍為0.21—0.33, 體重和體長的遺傳相關為0.97, 選育第3代時的遺傳進展比較大。2011年, Vandeputte等[5]從整個育種流程和理論上分析總結(主要涉及理論推導、數據模擬到真實育種3個層次), 基于分子標記的水產育種的育種效果, 證明了合適的標記對于實際育種很有意義,也證實了此種方法在鯉育種中的可行性。

在現有分子標記中, 微衛星因其長度表現為高度多態性, 已成為真核生物基因組作圖中不可缺少的分子遺傳標記。利用微衛星的結構特點和遺傳特性, 繪制高精度遺傳圖譜, 進行個體、品種(系)鑒定是微衛星的用途之一。Cheng等[6]和Zhang等[7]分別通過微衛星構建了鯉遺傳連鎖圖, 隨后與BAC文庫構建的物理圖相結合, 產生了高密度圖譜[8]。SNP是指在染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性, 主要包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等形式。Xu等[9]從4個鯉品種的轉錄組測序結果中尋找SNPs位點。隨后, 他們在2014年構建了第一個高通量的SNP芯片, 其包含25萬個SNPs位點, 在檢測的1072個樣本中約74.06%具有多態性[10]。此后, Zhang等[11]再次通過分子標記構建了鯉連鎖圖并研究了與鯉肌纖維相關的QTL (Quantitative trait locus, QTL)。可以看出在鯉育種領域積累了大量的分子標記和有效的檢測方法, 并做了相應的分子育種工作。

研究報道表明相比傳統的BLUP選育, 基于高額成本的基因型檢測的育種可獲得較高的遺傳進展[12]。如果遇到遺傳進展不夠大或難以支持如此高的基因型檢測成本的情形, 結合傳統的BLUP估計、候選個體的預選擇和低密度SNP芯片的應用是克服這些困難的好的選擇[1]。 因此, 基于實際情況本文通過篩選到的微衛星和SNP分子標記來研究它們富集后對鯉選育群體體重的影響。然而對于體重這種復雜的經濟性狀, 表型和基因型之間并不存在嚴格的一一對應關系, 而往往是參與表型形成的因素涉及同一位點上等位基因產生的加性效應和顯性效應、不同位點上非等位基因相互作用產生的上位效應以及這些基因與環境的共同作用[13]。因此, 本文在獲得與體重顯著相關的分子標記后,尤其是多個分子標記后, 明確這些標記通過哪幾種遺傳效應影響該經濟性狀是充分利用這些標記進行育種的重要參考和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選用的試驗魚均養殖于中國水產科學研究院淡水漁業研究中心無錫南泉養殖試驗基地,隨機選取450個黃河鯉選育候選個體, 其中親本168尾, 子代282尾。這些試驗魚是中國水產科學研究院淡水漁業研究中心通過基于家系的BLUP選育和分子設計育種結合開展選育的黃河鯉核心群。具體養殖辦法是根據BLUP選育原理和分子設計育種結合的選配方案挑選出親魚進行繁殖配對, 繁殖的條件是水溫為18—20℃, 配對的雌魚和雄魚的近交系數低于2%; 雌魚和雄魚配對后放入置有棕櫚片制成的魚巢(水位高度為85—90 cm)1d后, 將魚巢轉入孵化網箱中進行孵化3—4d后, 得到子代魚苗;要求將不同家系的魚苗隔離在不同的網箱中進行早期培育, 溫度控制在20—28℃內, 水位高度設置為70—80 cm; 要求每半月加注1次新水; 孵出魚苗后的第2至第15天潑灑豆漿進行喂養, 每日潑灑2—3次, 之后用顆粒飼料喂養, 每日投喂2—3次, 投喂量為魚苗體重的5%—6%; 當魚苗長到7—15 g時,在每個家系中各選50尾魚苗用注射器將無線射頻標記注入魚腹腔, 進行個體標記, 從而識別每尾魚苗; 將標記好的魚苗在室內水泥池暫養, 用顆粒飼料喂養, 每日投喂2—3次, 投喂量為魚苗體重的3%—4%; 喂養5—7d后, 將標記后的魚苗轉入室外土池中進行常規養殖, 飼料為商用成魚料, 養殖到第3年的3月份測生長性能數據并鑒別雌雄。

本實驗中的子代來自于親魚群體, 親魚的平均體重為1747.23 g, 子代的平均體重為946.49 g。要求親本對本文所使用引物(表 1)全部檢測, 子代則要求進行Koi42微衛星多態性檢測。在進行體重稱重時, 采用丁香油與乙醇的混合液將黃河鯉麻醉后,采用電子天平稱量體重(精確到1 g), 同時剪取的尾鰭立即于95%的酒精中固定, 采樣完畢, 樣品置于-20℃冰箱保存。按照TaKaRa DNA提取試劑盒說明書提取DNA。采樣的同時記錄采樣個體的體重,親本還需記錄性別。

1.2 分子標記的多態性檢測

分子標記的檢測分為2種情況進行檢測, 微衛星主要是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后統計位點的基因型, SNP通過PCR反應后直接測序, 獲得的序列使用DNAMAN V6軟件進行序列比對, 并通過Chromas2.22軟件核查, 確定SNPs。

PCR反應體系為25 μL, 包括10×buffer 15 μL, Mg2+(25 mmol/L) 1 μL, dNTPs (各2 mmol/L) 1 μL,上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, 模板DNA 1 μL, Taq DNA聚合酶(Promega)1 U, dd H2O; 擴增反應均在TaKaRa公司PCR儀上完成。PCR反應程序為: 94℃預變性3min; 94℃變性20s, 溫度56—66℃退火20s, 72℃延伸30s, 33個循環; 72℃延伸10min。將反應后的PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合goldview顯色進行檢測。如果是SNP位點,送到Introvigen上海生物技術有限公司測序。

1.3 數據的統計分析

數據錄入到Office2010, 通過R3.1.14軟件的線性模型篩選多態位點。采用Natural and Orthogonal InterActions(NOIA)模型計算已篩選位點的上位效應對體重的影響, 并對這些個位點影響體重的遺傳方差進行剖分, 使用的是R軟件包noia[18—20]。

表 1 用于分子標記篩選的基因及微衛星引物序列Tab. 1 Primers of different genes and microsatellite used to explore the candidate molecular locus

2 結果

2.1 本文所使用多態性位點的篩選結果

將線粒體基因COⅠ、D-loop以及IGF (Insulin like growth factor, IGF)家族基因IGF2R、IGF2a基因進行分段克隆、測序、尋找潛在的SNPs; 微衛星引物是通過PCR擴增、電泳分析并統計基因型, 然后將SNPs和微衛星基因型與生長性狀進行關聯統計, 獲得對體重有顯著影響的多態位點(圖 1), 其描述的不同純合基因型之間存在顯著差異, 然后統計基因型頻率(表 2)。而測序的SNPs位點必須經過測序峰圖進行驗證, 保證其準確性。

2.2 HLJ13、MFW4、MFW7、MFW11、Koi42、IGF2a4#、IGF2R第一內含子、COⅠ和D-Loop基因生長優勢基因型的富集性個體篩選

對所有的具有生長優勢的各個標記基因型進行親本的富集性檢測(表 3)。可以看出, 獲得具有超過2個優勢位點的候選親本共13尾。然后對富集優勢的候選親本進行生長性能標記效果檢測(圖2)。可以看出, 富集優勢分子標記基因型的候選親本生長性能優勢明顯。

2.3 所篩選位點對體重的貢獻率

為了研究這些個位點對體重的貢獻率, 通過多元逐步回歸分析, 利用AIC最佳模型篩選到COⅠ626、D-Loop 253和Koi42共3個分子標記。首先, 把性別和這3個分子標記作為自變量, 發現它們的貢獻率從大到小分別是性別(9.153381e-01)、D-Loop 253 (8.481305e-04)、Koi42 (9.883973e-05)、COⅠ626 (7.514281e-05), 而且3個分子標記只有DLOOP253達到顯著水平 。當去掉性別時, 發現3個位點的貢獻率依大小順序為: Koi42 (0.105199624)、D-Loop (0.022124762)、COⅠ626 (0.005664277)。綜合這2個模型(有無性別作自變量)以及貢獻率的大小可以推斷Koi42位點可能與性別有一定的關聯。經過Fisher精確性檢驗, 發現二者在所研究群體中確實存在關聯。

2.4 所篩選分子標記的上位效應和遺傳組分剖分

本文針對所篩選分子標記作遺傳分析發現: 3個分子標記均存在加性效應, Koi42可以檢測到顯性效應, 檢測到多個上位效應組分, 僅有D-Loop 253和Koi42的加性效應間的互作達到顯著水平(表4)。對遺傳方差組分進行剖分發現, 加性方差占11.4%, 兩個位點的加性效應構成的上位效應占到77.5%, 3個位點加性效應構成的上位效應占到11.1%, 因此這3個分子標記對體重的影響主要以上位效應為主, 而且是兩兩加性效應的占比較大, 可以推斷出D-Loop 253和Koi42兩個分子標記的上位效應起主要作用。

3 討論

3.1 富集分子標記親本的選擇

如前所述, 分子輔助育種在鯉中已經成功使用。對于富集SNPs的個體選擇, 李紅霞等[21]檢測了900尾建鯉的鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC) jlODC1a基因上6個和jlODC1b基因上4個SNP位點, 發現了7個SNPs與建鯉增重顯性相關, 富集4個的平均增重顯著快于富集0—3的個體增重, 且比0標記的快約14%。這與本文中富集優勢位點的親本較未進行分子標記篩選的親本具有較高的增重是一致的。

圖 1 供篩選微衛星的引物和基因SNPs與體重的關聯分析Fig. 1 Correlated analysis between candidate genotype of microsatellite and functional gene SNPs and body weightA. 表示COⅠ基因的第626位置出現的SNP位點不同基因型之間體重差異顯著; B. 表示D-Loop基因的第253位置出現的SNP位點不同基因型之間體重差異顯著; C. 表示IGF2a基因的設計的4#引物擴增出的SNP位點不同基因型之間體長體重比值差異顯著; D. 表示IGF2R基因的第1內含子檢測到的SNP位點不同基因型之間體重差異顯著; 以上4個基因都是對親本群體的檢測效果, E. Koi42微衛星引物是對子代的基因型檢測, 做分析時, 做了對數轉換, 保證體重數據服從正態分布A. the significant body weight difference between two genotypes of 626thposition in COⅠ; B. the significant body weight difference between two genotypes of 253thposition in D-Loop; C. the significant body length/body weight difference between two genotypes of IGF2a4#primers amplified product; D. the significant body weight difference between two genotypes of IGF2R intron 1 amplified product; Such four genes SNPs were used to observe the genotype of parent individuals, while Koi42 in this graph is used to explore the genotype of offspring. Vertical line showed the logical bodyweight in order to conform the Gaussian distribution

為了弄清楚這些分子標記是通過什么樣的遺傳效應影響目標性狀的, 在本研究中, 通過多元逐步回歸進一步篩選SNPs位點, 得到3個多態位點, 這提示此3個位點可用于黃河鯉新品系的選育。深入分析發現Koi42位點加性效應接近顯著水平, 貢獻率最大, 因此該位點對于黃河鯉選育群體的育種值的計算有更為重要的作用, 可賦予較大的權重。有趣的是該位點與性別存在著一定的關聯(Fisher精確檢驗), 這意味著對于性成熟較晚的鯉, 可用該位點進行早期選擇(獲取雌魚信息)。盡管本文樣本量已經達到450尾魚, 但是具體的關聯程度還需擴大樣本量檢測。

表 2 所篩選的與生長相關不同基因或微衛星引物所對應的基因型及頻率Tab. 2 Genotypes and their frequency of different genes or microsatellite

表 3 黃河鯉親本的多態性位點富集情況Tab. 3 Polymorphism explored enrichment in the Huanghe carp candidate parents

3.2 不同位點間的上位效應

圖 2 經過分子標記篩選到的親本具有顯著的體重差異(數據進行了正態分布檢驗, 做了對數轉換)Fig. 2 Significant body weight difference was observed between candidate parents with selected loci and others without these loci (Vertical line showed the logical bodyweight in order to conform the Gaussian distribution)

表 4 所篩選3個位點的遺傳效應分析Tab. 4 Genetic effect analysis of selected 3 loci

1918年Fisher從群體水平上提出上位效應是指不同位點上基因的相互作用, 其效應值是對單位點簡單加性效應的偏離值[22]。隨后的研究表明上位效應為功能基因間的表達調控網絡[23]。本研究發現加性效應間、加性效應和顯性效應間的多種上位效應, 但僅有D-Loop 253和Koi42的加性效應間的互作達到顯著水平, 因此, 二者富集型個體的留種也是對該上位效應的選擇, 也可能是黃河鯉新品系體重基因調控網絡模式[24]之一。戶國等[25]研究發現對肉雞7周齡腹脂率有顯著影響的載脂蛋白B基因T123G位點和解偶聯蛋白基因C1197A位點存在基因間的上位效應組分, 并認為這種遺傳互作模式可能是影響脂肪性狀的重要因素。因此, 對目標性狀有顯著影響的多個分子標記的富集選擇是一種有效的育種手段。

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CANDIDATE PARENTS SELECTION CONTAINING MULTIPLE GENOTYPES WITH HIGHER PERFORMANCE AND CORRELATED MOLECULAR MARKERS’ GENETIC EFFECTS ANALYSIS

ZHANG Cheng-Feng1, SU Sheng-Yan1, ZHU Jian1and SHI Lian-Yu2
(1. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Breeding, Ministry of Agriculture, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China)

Marker assistant breeding, molecular breeding and genome wide breeding can shorten the generation interval of germplasm improvement and creation, speed up the selection response. Contrast with traditional best linear unbiased prediction (BLUP), they can achieve the higher genetic gain with the higher cost. Practically, together with BLUP, pre-selection of candidate individuals, low density array, they will become an optional choice under the consideration of selection cost and efficiency. So, in the present article, we focus on the effect of limited markers enrichment on the candidate population growth performance.e.g. body weight. For the body weight phenotype can not only be determined by one genotype, but also by multiple loci additive effect, dominant effect and epitasis. Thus, multiple loci explored needed to do variance components analysis and identify the specific genetic effect of these loci. A total of 450 fish (parents and their offspring) were collected, which were from Nanquan farm in Freshwater Fisheries Research Center in Chinese Fishery Academy. A total of 5 microstallites primers and 4 primers used for functional gene regional amplification were selected to observe the corresponded genotypes of such individuals. Correlation analysis between effective molecular markers and body weight of Huanghe carp new strain and genetic effect analysis of such markers were examined too in the present paper. The result showed that, microstallite Koi42 and 4 SNPs from the functional genes have significant effect on the carp's body weight. 13 candidate parents which have over two genotypes with higher body weight were developed. These individuals have better growth performance compared to that without these perfect genotypes. Further analysis by multiple step-wise regressions was conducted in order to make sure which markers can be implicated in practical breeding together effectively. CO626, D-Loop 253 and Koi42 were left by both linear regression analysis and AIC criteria, where Koi42 has the highest contribution to the body weight variation among 3 markers. It is that Koi42 genotypes is related with sex by Fisher exact test. Genetic analysis supply the information Koi42 plays its role by additive effect (P＜0.1). Among many epitasis components, significant effect between D-Loop 253 additive effect and Koi42 additive effect was found. Through variance components partition analysis, additive variance account for 11.4%, and effect of epitasis between two loci had the higher percentage (77.5%). This told us 3 mar-kers listed above contribute to the body weight mainly by epitasis. All of these results illustrated that Koi42 with its interaction partner D-Loop 253 could be used to marker assistant breeding or multiple markers based co-selection.

Huanghe carp new strain; Genotype; Body weight; Correlation analysis; Epitasis

Q347; S962.1

A

1000-3207(2017)01-0079-07

10.7541/2017.10

2016-01-24;

2016-04-11

農業部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室開放課題(FBB201401); “十二五”科技支撐計劃“大宗淡水主養魚類新品種選育”(2012BAD26B02); 中國水產科學研究院基本科研業務費(2016RC-LX03)資助 [Supported by the Open Project of Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Breeding in Ministry of Agriculture (FBB201401); the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-Year Plan Period (2012BAD26B02); Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Chinese Academy of Fishery Sciences (2016RC-LX03)]

張成鋒(1979—), 男, 山東德州人; 博士研究生; 研究方向為水產養殖。E-mail: zhangcf@ffrc.cn

石連玉(1960—), 男, 研究員; 研究方向為水產育種。Tel: 0451-84861311, E-mail: sly2552@aliyun.com