遠程缺血后適應降低心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

蔣欽，黃克力，張浩，胡盛壽

基礎與實驗研究

遠程缺血后適應降低心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

蔣欽，黃克力，張浩，胡盛壽

目的：探討遠程缺血后適應對心肌缺血再灌注的氧化還原、能量代謝及炎癥反應的影響。

心肌再灌注損傷；缺血后適應；反饋，生理

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:85.)

再灌注通過及時的恢復冠狀動脈血流雖是挽救缺血心肌的唯一方法，但是可以導致附加損傷[1]。缺血性適應是一種內源性的保護策略，通過多次簡短有效的實施缺血、再灌注方式實現保護器官減輕缺血再灌注損傷[2]。按照施行缺血適應與有害缺血的時間先后關系，可分為預適應、間適應以及后適應[3]。遠程缺血適應通過在某一組織或血管區域而非靶器官實施數次間斷的缺血和再灌注方案，達到降低重要器官缺血再灌注損傷的作用。由于不在目標器官實施缺血因而避免潛在加重靶器官缺血損傷，其臨床應用意義尤為突出[4]。但其是否能夠達到缺血預適應、缺血后適應的作用效應尚不清楚。本研究旨在探討遠程缺血后適應在心肌再灌注損傷發生時應用的效應，并與缺血預適應及缺血后適應比較其抗氧化還原、抗脂質過氧化反應、抗炎癥反應以及影響能量代謝等作用效應。

1 材料與方法

實驗動物與方法：實驗動物為SPF級SD 大鼠，均由北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供，6～8周齡，體重250～300 g，雌雄各半。將40只大鼠隨機分為5組，如圖1所示：（1）缺血預適應組（n=8）：心肌缺血30 min再灌注120 min前接受3次30 s缺血與再灌注交替的缺血預處理；（2）缺血后適應組（n=8）：心肌缺血30 min后再灌注開始后即行阻斷冠狀動脈開放30 s，阻斷30 s，重復3次，再灌注至缺血完成后120 min；（3）遠程缺血后適應組（n=8）：心肌缺血30 min后即開放再灌注120 min，同時左下肢腹股溝處行開放股動脈30 s，阻斷股動脈血流30 s，重復3次；（4）缺血再灌注組（n=8）：心肌缺血30 min后完成再灌注120 min；（5）對照組（n=8）：單純開胸，冠狀動脈左前降支只在周圍肌層穿線不行結扎。采用冠狀動脈前降支阻斷法建立心肌缺血再灌注模型[5]。基本方法為以6-0 prolene線于左心耳與肺動脈流出道交匯處以遠2 mm處做橫向縫扎；縫扎的中點位于左心耳與肺動脈流出道交匯處與心尖連線，進針方向與連線垂直，進針深度為1.5 mm左右。如心臟跳動減弱或心尖區域顏色變白可大致證實心肌缺血模型制作成功，不明顯者再次縫扎。如有心律失常發生，給予低濃度利多卡因紗布敷蓋左心室或心臟按摩。若缺血30 min后無左心擴大變白或運動不協調，則認為心肌缺血模型制作不合格。

圖1 缺血性適應的研究方案（n=8）

觀察指標：缺血再灌注治療后120 min所有組實驗觀察結束，采用靜脈注射氯化鉀的方法處死大鼠；收集大鼠左心室的缺血邊緣心肌，生理鹽水清理后分裝入凍存管內，常規液氮保存組織標本待后續實驗使用。檢測氧化應激、脂質過氧化水平、炎癥反應及能量代謝水平；按照試劑供應商提供的檢測方案分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定各組預處理后心肌缺血組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量[5]，通過化學比色法測定髓過氧化物酶（MPO）活性，生物發光法檢測三磷酸腺苷（ATP）含量[6]，所選試劑盒均來自南京建成生物工程研究所，采用日本Shimadzu公司分光光度計（UV-1206）檢測（n=4）；實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法分別檢測各種預處理區內心肌組織中基質細胞衍化因子-1（SDF-1）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，以及線粒體相關基因Ndufa2、Ndufa4、Cox4il、Cox7a2的表達（n=4），采用美國ABI公司的實時熒光定量PCR儀（ABI-7300）檢測，參考之前研究方法，引物序列如下，SDF-1正向: TGAGAGCCATGTCGCCAGA，反向：GGATCCACTTTAATTTCGGGTCAA；VEGF正向: GTCCTCACTTGGATCCCGACA，反向：CCTGGCAGGCAAACAGACTTC[6]。

統計學分析：應用SPSS 17.0 軟件包進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示；三組及以上比較采用單因素方差分析，若差異有統計學意義，使用SNK法檢驗確立哪些組間均數不等。組間差異性比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物模型結果

心肌缺血模型制作參考既往的工作基礎[6]，手術方式較固定，大鼠模型的制作成功率約在80%，主要的死亡原因是由于解剖變異因素結扎冠狀動脈分支過多或者靠近主干開口導致心肌梗死面積太大，也包括呼吸系統原因如術后氣胸形成等。

2.2 缺血心肌中氧化應激與脂質過氧化水平比較

缺血再灌注施行后120 min，各組SOD活性 （圖2A）與MDA含量（圖2B）水平值如圖2所示。再灌注后120 min，缺血預適應組、缺血后適應組、遠程缺血后適應組三組間缺血心肌中抗氧化應激指標SOD活性差異無統計學意義，但明顯高于缺血再灌注組（P＜0.05），但與對照組比較差異均無統計學意義。而脂質過氧化指標MDA含量，對照組最低（P＜0.01），缺血預適應組、缺血后適應組、遠程缺血后適應組三組間差異無統計學意義，但均明顯低于缺血再灌注組（P＜0.01）。

2.3 缺血心肌中保護性基因表達水平比較

缺血再灌注施行后120 min各組SDF-1與VEGF表達水平如圖2C所示。SDF-1與VEGF在缺血預適應組、缺血后適應組、遠程缺血后適應組三組間差異無統計學意義，但均明顯高于缺血再灌注組（P＜0.05），但均較對照組表達增加（P＜0.05）。

圖2 大鼠缺血心肌中氧化應激、脂質過氧化反應與保護性基因表達情況（n=4）

2.4 缺血心肌中線粒體功能相關基因表達水平比較

缺血再灌注施行后120 min各組線粒體功能相關基因Ndufa2、Ndufa4、Cox4il、Cox7a2表達水平如圖3A所示。相對于對照組，由于缺血再灌注損傷作用缺血再灌注組顯著降低；缺血預適應組、缺血后適應組、遠程缺血后適應組三組間差異無統計學意義，但明顯高于缺血再灌注組（P＜0.05）。

2.5 缺血心肌中能量代謝與炎癥反應水平比較

缺血再灌注施行后120 min各組能量代謝與炎癥反應水平如圖3B、3C所示。心肌內ATP含量在缺血預適應組、缺血后適應組、遠程缺血后適應組三組間差異無統計學意義，但明顯高于缺血再灌注組，對照組ATP含量最高（P＜0.05，圖3B）。反應心肌內炎癥反應指標的MPO活性在缺血預適應組、缺血后適應組、遠程缺血后適應組三組間差異無統計學意義，但明顯低于缺血再灌注組， 對照組MPO活性最低（P＜0.05，圖3C）。

圖3 大鼠心肌線粒體能量代謝相關基因表達及炎癥反應水平比較（n=4）

3 討論

缺血再灌注損傷發生的具體機制不清，但主要涉及通過氧化應激反應，線粒體功能異常導致能量代謝障礙，炎癥反應等作用[2]。本研究將遠程缺血后適應與常規的缺血預適應、缺血后適應分組納入比較，目的是將作用效果相對確切的兩種方案作為參照標準，評價其有無相似的作用效應。

目前，通過這種在遠離心臟的一個器官或組織施行簡短的缺血和再灌注，最初發現是在不同冠狀動脈分支區域，產生急性缺血再灌注損傷的保護作用機制仍不清楚[7]。實驗研究表明，在受保護器官中很多潛在的機制通路和信號轉導網絡可能類似于缺血預適應和缺血后適應[8]。然而，從遠程預適應的器官或組織傳遞心臟保護信號到達心臟的機制通路仍不清楚。

現有研究表明，遠程缺血適應主要通過體液因素與神經系統作用。遠程缺血適應可以通過其作用體液在不同物種(豬-鼠)間發揮作用[9]，傳統觀點認為體液因素參與機制包括：一氧化氮、腺苷、緩激肽[10]、細胞因子、趨化因子等。通過給予神經節阻斷藥、切斷肢體的神經支配，基因抑制腦干迷走神經節前神經元，切除心臟的迷走神經支配都可以消除肢體缺血適應誘導降低心肌梗死的作用[11]。在遠程缺血適應處理后的器官或組織中神經通路刺激看上去是由局部產生活性物質，例如腺苷和緩激肽。一些新穎的小分子物質近年來也被認為是作用分子，如MicroRNA和SDF-1[12，13]。同期我們也觀察到缺血后適應可以誘導慢性心肌梗死的SDF-1的表達[14]，建立心肌—血液間濃度梯度差，從而產生類似于急性心肌梗死期SDF-1變化，誘導干細胞自發地向缺血心肌“歸巢”現象。此研究將三種缺血性適應做橫向比較，是先前研究發現通過缺血后適應降低缺血損傷的微環境的證實和補充[6]，同時從四個方面比較減輕再灌注損傷的作用效應。不同于傳統的效應研究機制，我們從四個方面的指標評價遠程缺血后適應的作用機制。第一：抗氧化還原和脂質過氧化指標，SOD是清除再灌注損傷產生的氧自由基的主要物質，MDA是膜脂質過氧化的重要產物，可以反應細胞膜因缺血破壞的嚴重程度。相對于缺血再灌注作用結果，三種缺血性適應均可增加SOD活性且降低MDA含量，證實了遠程缺血后適應同樣具有抗氧化應激，減輕膜脂質過氧化作用。第二：遠程缺血后適應增加心肌損傷后的保護因子合成，缺血損傷后心臟具有一定的適應應激損傷的能力，通過改變表型使其更耐受損傷[15]。SDF-1是具有募集干細胞和直接修復雙重作用的重要蛋白[16]。SDF-1可在缺血后表達上調具有一定的心臟適應修復作用，但這種效應具有短暫且有限的時空效應。這與之前缺血后適應可以誘導慢性心肌梗死后心肌SDF-1的表達上調類似，我們觀察到遠程缺血后適應可以增加缺血再灌注心肌SDF-1的表達，這種效應可以進一步增加心臟修復損傷作用。VEGF可以誘導毛細血管新生，降低內皮損傷，也具有直接減輕再灌注損傷的作用[17]。第三：線粒體功能及能量代謝方面，線粒體是心肌細胞中最活躍也是最重要的細胞器，消耗大約90%的氧氣，參與95%的心臟ATP合成和氧化磷酸化[18]。因此我們檢測直接反應能量儲備的ATP水平，缺血再灌注損傷可導致ATP明顯下降，而三種缺血性適應均可減輕ATP儲備水平的受損；與ATP水平降低一致的表現，缺血再灌注損傷相對于對照組可導致能量代謝相關基因表達下降[19]，遠程缺血后適應誘導線粒體能量代謝相關的基因表達上調。第四：炎癥反應情況，我們使用MPO指標，一種存在于白細胞內，作為組織炎癥細胞侵入的指標[20]。再灌注損傷的一種表現即為微血管堵塞[8]，甚至心肌出血，這種無復流現象發生在約40%成功再灌注的ST段抬高型急性心肌梗死患者，其發病機制包括微血管舒張受損、微血管栓塞、血小板微栓、中性粒細胞堵塞[21]。

與晚期后適應的作用不同，再灌注即時或早期缺血后適應的保護機制涉及到激活再灌注損傷挽救激酶信號通路和幸存活化增強信號因子途徑通路[22]，這與缺血預適應的作用機制存在部分重疊。研究發現緩激肽與其受體在缺血預適應誘導的心臟保護作用主要通過激活磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶/內皮型一氧化氮合酶(PI3K/ Akt/eNOS)和通過釋放一氧化氮調節氧化還原狀態;缺血后適應誘導的保護作用主要是增加抗氧化還原和激活線粒體抗凋亡通路；而在遠程缺血預適應中通過激活B2受體介導神經源性通路并內化B2受體形成信號體[23]，這些單元里包括各種信號通路的酶，遷移到線粒體后激活線粒體ATP敏感性鉀通道，轉導細胞內細胞保護信號通路[10]。由此可見各種缺血性適應的心臟保護作用可能通過一些共同的信號通路實現。本研究中三種缺血適應方式降低缺血再灌注損傷的作用效果相似，其作用發生的信號通路也可重疊，從而產生相同心臟保護作用，但這三種方式具體的作用機制和交互關系仍有待將來的研究闡明。

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Investigation of Remote Ischemic Post-conditioning on Reducing Ischemic Reperfusion Injury in Experimental Rats

JIANG Qin, HUANG Ke-li, ZHANG Hao, HU Sheng-shou.
Center of CardiacSurgery, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu (610072), Sichuan,China Corresponding Author: HUANG Ke-li, Email: huangkeli1968@163.com

Objective:To explore the effect of remote ischemic post-conditioning (RIPoC) on oxidation/reduction response, energy metabolism and inflammatory reaction of ischemic myocardial tissue in rats with ischemic reperfusion (IR) injury.Methods: IR model was established by 30 min left anterior descending (LAD) artery occlusion followed by 120 min reperfusion, conditioning was defined as 3 cycles of 30 seconds ischemia followed by 30 seconds reperfusion in adult rats. The rats were divided into 5 groups:①ischemic pre-conditioning (IPC) group, the rats received the conditioning prior to IR treatment,②ischemic post-conditioning (IPoC) group, the rats received 30 min LAD occlusion followed by conditioning at the beginning of 120 min reperfusion,③remote ischemic post-conditioning(RIPoC) group, the rats received 30 min LAD occlusion, followed by femoral artery conditioning at the beginning of 120 min reperfusion,④IR group,⑤Sham group. n=8 in each group.Ischemic myocardial tissue was collected at the end of experiment, superoxide dismutase (SOD) activity was assayed by xanthine oxidase method,malondialdehyde (MDA) content was examined by thiobarbituric acid method, myeloperoxidase (MPO) activity was determined by chemistry colorimetric method, adenosine triphosphate(ATP)amount was measured by bioluminescence method; expressions of myocardial stromal cell derived factor-1 (SDF-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF), mitochondrial function related genes Ndufa2, Ndufa4, Cox4il and Cox7a2 were evaluated by real time quantitative PCR.Results:In IPC, IPoC and RIPoC groups, the ischemic myocardial tissue had increased SOD activity and ATP amount, decreased MDA content and MPO activity; induced expressions of SDF-1, VEGF, mitochondrial function related genes Ndufa2, Ndufa4, Cox4il and Cox7a2.Conclusion: RIPoC may increase anti-oxidation/reduction response, protect energy metabolism and reduce inflammatory reaction in ischemic myocardial tissue, the effect was similar to pre-conditioning and post-conditioningin rats with IR injury.

Myocardial reperfusion injury; Ischemic post-conditioning; Feedback; Physiology

2016-04-23）

（編輯：漆利萍）

四川省人民醫院博士科研基金（30305030842）

610072 四川省成都市，四川省人民醫院 心臟外科中心（蔣欽、黃克力）；中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心阜外醫院 心血管疾病國家重點實驗室（張浩、胡盛壽）

蔣欽 主治醫師 博士 主要從事冠心病外科基礎與臨床研究 Email: jq349@163.com 通訊作者：黃克力 Email: huangkeli1968@163.com

R541

A

1000-3614（2017）01-0085-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.01.020

方法：阻斷成年SD大鼠冠狀動脈左前降支30 min再灌注120 min的方式建立缺血再灌注模型；分別以3個周期30 s缺血、30 s灌注的方式建立缺血預適應、缺血后適應、遠程缺血后適應的缺血適應模型；開胸后不阻斷冠狀動脈建立對照組模型。實驗結束收集大鼠缺血心肌組織，通過黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性和硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量，化學比色法檢測髓過氧化物酶（MPO）活性，生物發光法檢測三磷酸腺苷（ATP）含量；實時定量聚合酶鏈反應法分別檢測基質細胞衍化因子-1（SDF-1）和血管內皮生長因子（VEGF），以及線粒體功能相關基因Ndufa2、Ndufa4、Cox4il、Cox7a2表達（n=8）。

結果：缺血預適應、缺血后適應、遠程缺血后適應均顯著增加缺血心肌組織的SOD活性、ATP含量；降低MDA含量、MPO活性；并可以誘導SDF-1、VEGF及線粒體功能相關基因Ndufa2、Ndufa4、Cox4il、Cox7a2的表達。

結論：遠程缺血后適應應用在缺血再灌注損傷時有增加缺血心肌組織的抗氧化還原、保護能量代謝、降低炎癥反應等作用；遠程缺血后適應與缺血預適應及缺血后適應降低缺血再灌注損傷的作用效果類似。