Sanger測序法和突變擴增阻滯系統法檢測非小細胞肺癌EGFR基因19、21號外顯子突變的臨床價值比較

王建華 李紀鵬 金明威 李珊鳳

Sanger測序法和突變擴增阻滯系統法檢測非小細胞肺癌EGFR基因19、21號外顯子突變的臨床價值比較

王建華 李紀鵬 金明威 李珊鳳

目的 比較Sanger測序法和突變擴增阻滯系統（ARMS）法檢測非小細胞肺癌（NSCLC）EGFR基因19、21號外顯子突變的臨床價值。方法收集經病理組織學確診的NSCLC患者肺部原發或轉移癌標本102例，其中石蠟包埋組織75例，病理活檢標本27例；采用Sanger測序法和ARMS法檢測上述標本EGFR基因19、21號外顯子突變情況，分析其與患者臨床病理學特征的關系。結果ARMS法突變檢出率為48.0%（49/102），高于Sanger測序法的32.3%（31/96），兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。病理活檢組織ARMS法突變檢出率為57.1%（12/21），明顯高于Sanger測序法的23.8%（5/21），差異有統計學意義（P＜0.05）；石蠟包埋組織ARMS法和Sanger測序法突變檢出率分別為49.3%（37/75）和34.7%（26/75），兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。女性患者EGFR基因突變檢出率68.0%高于男性患者的28.8%，未吸煙患者突變檢出率65.5%高于吸煙患者的27.7%，腺癌患者突變檢出率62.3%高于鱗癌患者的26.8%，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；但EGFR基因突變檢出率和有無淋巴結轉移及年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。結論EGFR基因19、21號外顯子突變好發于女性、未吸煙患者和腺癌患者，Sanger測序法對大組織樣本及未知突變檢測更有優勢，ARMS法對病理活檢、微小樣本及要求靈敏度高的樣本檢測更為適合，結合2種方法檢測結果更為全面可靠。

非小細胞肺癌 表皮生長因子受體 基因突變 外顯子 Sanger測序 ARMS法

【Key words】Non-small lung cancerEpidermal growth receptorGene mutation Exon Sanger sequencing Amplification refractory mutation system assay

肺癌是我國發病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，其中80%以上為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），患者5年生存率不足20%[1]。研究發現表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶結構域存在突變的肺癌患者對靶向藥物具有高度敏感性[2]。EGFR基因突變是臨床藥物治療選擇的一個重要因素[3-4]，突變主要集中在EGFR基因19、21號外顯子上。晚期肺癌患者主要采用放療加化療加靶向藥物治療模式[5]，因而需要明確EGFR基因突變類型及其相關臨床病理學特征以便篩選出受益的優勢人群。本文通過Sanger測序法和突變擴增阻滯系統(amplification refractory mutation system,ARMS)法對102例NSCLC患者組織標本進行EGFR基因突變檢測，比較不同腫瘤組織標本的EGFR基因中19、21號外顯子突變情況及其臨床病理學特征，為臨床選擇最佳治療方案提供實驗依據。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2013年10月至2015年5月在本院就診且經病理組織學確診的NSCLC患者肺部原發或轉移癌標本102例，其中男52例，女50例；年齡36～85歲，中位年齡65歲；石蠟包埋組織75例，病理活檢標本27例；病理分型依據肺癌WHO分型標準：腺癌61例，鱗癌41例；淋巴結轉移87例，未轉移15例。樣本入組標準：5～10μm石蠟切片要求不少于10片，石蠟塊中組織區域占30%及以上，新鮮組織細胞不少于0.5g。

1.2 主要儀器及試劑 Mastercycler nexus梯度PCR儀（德國Eppendorf公司），ABI3500測序儀（美國ABI公司）、ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、日立雙光束紫外分光光度計U-2900（日本日立公司）、石蠟組織DNA提取試劑盒（56404）（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit）（德國Qiagen公司），人類EGFR基因3種突變檢測試劑盒ADx-EG04（熒光PCR法）（廈門艾德生物公司），2×Taq PCR Master Mix擴增試劑盒（KT-201）（北京天根生化科技有限公司），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒普通離心柱型（DP209-02）（北京天根生化科技有限公司），Bigdye terminator V3.1（美國ABI公司），擴增合成引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 研究方法 石蠟或新鮮組織裝入1.5ml EP管，分別按照石蠟組織DNA提取試劑盒和新鮮組織DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，紫外分光光度計檢測DNA濃度，提取的目的DNA在-20℃保存。

1.3.1 Sanger測序法 采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒分別擴增EGFR基因19、21號外顯子，引物擴增序列設計見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增反應體積為50μl，包括目的DNA 2μl、2×PCR反應緩沖液25μl、正反向引物（10μM）各2μl，ddH2O補足至50μl。循環參數：94℃預變性5min；94℃30s,55℃30s,72℃1min，共35個循環；72℃延伸5min。反應結束后，取50μl擴增后產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收PCR擴增產物，于-20℃保存，以進行后續的操作。采用Bigdye terminator V3.1試劑盒進行測序反應，反應總體積為 5μl，Bigdye 0.2μl，5×Bigdye sequence buffer 1μl，正反向引物0.5μl，PCR純化產物 1μl，用ddH2O補足到5μl。測序反應程序為96℃ 1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，共30個循環；60℃保溫。測序產物純化程序為2μl 125mM EDTA（pH 8.0）加入15μl無水乙醇，避光4℃靜置15min，4℃3 800g離心30min，倒置安放離心1min，加入70%無水乙醇70μl，離心15min，重新洗1次離心8min，倒置離心5s，靜置安放，待乙醇蒸發干凈。加入10μl HiDi溶解DNA，95℃變性5min，4℃10min，在ABI3500基因測序儀上進行雙向測序，測序結果用Blast軟件對比分析。在高質量測序峰圖的前提下進行結果判讀，野生型為高質量單峰；突變型為測序峰圖中出現套峰或雙峰，序列出現缺失或錯義。

表1 EGFR基因19、21號外顯子PCR擴增引物序列

1.3.2 ARMS法 將收集的樣本根據人類EGFR基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）說明書進行突變檢測，每次檢測程序都作陽性和陰性質控對照。每個8連管孔中待測樣本DNA濃度調整為：石蠟包埋切片樣本2～3ng/μl（即每單個反應管添加DNA量為10～15ng），病理活檢組織0.4～1ng/μl（即每單個反應管添加DNA量為2～5ng），樣品DNA使用TE（pH 8.0）稀釋，ABI7500實時熒光定量PCR儀進行檢測。PCR擴增參數為：95℃預變性5min；95℃25s，64℃20s，72℃20s，共15個循環；93℃25s，60℃35s，72℃20s，共26個循環。根據試劑說明書對檢測結果進行判斷：突變檢測管中FAM信號擴增曲線的Ct值＜29，則樣品為陽性；若FAM擴增信號曲線的Ct值≥29，則樣品為陰性。

1.3.3 EGFR基因突變與臨床病理特征的關系 以ARMS法檢測結果為前提，對EGFR基因突變與臨床病理特征（包括性別、年齡、有無吸煙、組織類型及有無淋巴結轉移）的關系進行分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗或配對χ2檢驗。

2 結果

2.1 2種方法突變檢出情況比較 ARMS法成功檢測102例標本，其中49例（48.0%）為EGFR突變；Sanger測序法成功檢測96例標本，其中31例（32.3%）為EGFR突變；ARMS法突變檢出率高于Sanger測序法，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。ARMS法檢出的49例突變標本中，29例為19號外顯子缺失突變，20例為21號外顯子的錯義突變，見圖1。Sanger測序法檢出的31例突變標本中，17例為19號外顯子缺失突變，14例為21號外顯子錯義突變，見圖2。

表2 2種方法檢測EGFE基因19、21號外顯子突變結果比較

圖1 ARMS法檢測EGFR基因19、21號外顯子突變結果

圖2 Sanger測序法檢測EGFR基因19、21號外顯子突變結果

2.2 2種方法檢測不同組織標本突變檢出情況比較為較好比較2種方法，排除Sanger測序法測序失敗的6例病理活檢標本。對病理活檢標本的檢測結果顯示，ARMS法突變檢出率為57.1%（12/21），明顯高于Sanger測序法的23.8%（5/21），差異有統計學意義（χ2=4.842，P＜0.05）；對石蠟包埋組織的檢測結果顯示，ARMS法突變檢出率為49.3%（37/75），Sanger測序法突變檢出率為34.7%（26/75），兩者比較差異無統計學意義（χ2=3.311，P＞0.05）。

2.3 EGFR基因突變檢出率與臨床病理特征的關系女性患者EGFR基因突變檢出率明顯高于男性患者，未吸煙患者EGFR基因突變檢出率明顯高于吸煙患者，腺癌患者EGFR基因突變檢出率明顯高于鱗癌患者，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；但EGFR基因突變檢出率和有無淋巴結轉移及年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 EGFR基因突變檢出率與臨床病理特征關系分析

3 討論

本研究結果顯示Sanger測序法檢測出31例發生EGFR基因突變，突變檢出率為32.3%；ARMS法檢測出49例發生EGFR基因突變，突變檢出率為48.0%。EGFR基因突變好發于女性、未吸煙患者和腺癌患者，這與孫孟紅等[6]報道結果一致。董剛強等[7]對394例肺癌EGFR基因突變情況進行檢測，結果發現EGFR基因突變主要發生在19和21號外顯子，以19號外顯子的del-E746-A750缺失突變和21號外顯子的L858R點突變為最常見的突變形式，其中19號外顯子del-E746-A750缺失突變約占其總突變率的74%，21號外顯子的L858R點突變約占其總突變的94.4%，而19號外顯子的del-L747-P753insS突變和21號外顯子的L861Q突變僅占各自突變的2.7%和3.7%。本研究采用Sanger測序法和ARMS法均只檢測到19號外顯子del-E746-A750缺失突變和21號外顯子L858R點突變，這可能與檢測樣本量偏少和其他類型突變發生率本身較低有關。

Sanger測序法被認為是檢測EGFR基因突變的金標準，其優勢在于對已知和未知突變都有良好的檢測重復性，其局限是靈敏度低，要求突變細胞不低于總標本的20%以上，操作耗時長，結果判讀復雜[8]，并且測序結果判讀依賴于測序峰中是否出現突變波峰。在獲得目的片段時，目的基因的突變與非突變區域都被擴增，因此當組織中腫瘤細胞少，或突變腫瘤克隆少時，引起突變峰低甚至無法檢測，導致結果假陰性。ARMS法其優勢在于檢測靈敏度高，檢測周期短，操作簡便，尤其適合微小組織標本[9]；其局限性在于檢測成本高，只針對已知突變進行檢測。

2種方法對不同標本類型檢測結果來看，Sanger測序法和ARMS法對于含有效腫瘤組織標本的檢測有較好的檢測一致性，而對于小的活檢標本，ARMS法檢測優勢更為明顯。本研究中，Sanger測序法對6例病理活檢標本檢測失敗，分析原因可能是：（1）對標本處理及獲得目的片段過程中引起標本DNA片段化，其擴增長度低于測序檢測要求；（2）腫瘤取材越少對腫瘤整體基因代表性越差，因而腫瘤細胞比例較低的活檢標本無法達到測序檢測下限。為了得到較為準確的結果，需選用靈敏度較高、對標本質量要求低的檢測方法。趙婧雅等[10]采用Sanger測序法和ARMS法對NSCLC活檢小標本EGFR基因進行檢測，發現Sanger測序法突變檢出率低，且檢出結果對臨床TKI療效可靠性下降，因此對活檢標本應選擇檢出率及靈敏度更高的ARMS法。

綜上所述，比較NSCLC的EGFR基因突變的2種檢測方法，Sanger測序法對大組織樣本及未知突變檢測更有優勢，ARMS法對病理活檢、微小樣本及要求靈敏度高的樣本檢測更為適合，2種方法結合檢測結果更為可靠。

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Detection of EGFR gene 19 and 21 exons mutations in non-small cell lung cancer by Sanger sequencing versus amplification refractory mutation system assay

ObjectiveTo compare Sanger sequencing and amplification refractory mutation system(ARMS)assay in detection of EGFR gene 19 and 21 exons mutations in non-small cell lung cancer(NSCLC).MethodsOne hundred and two NSCLC specimens,including 75 paraffin tissue samples and 27 biopsy specimens were collected.Mutations of EGFR gene 19 and 21 exons were detected by Sanger sequencing and ARMS assay.The association of gene mutations with clinicopathological features of NSCLC was analyzed.ResultsThe mutation rates of ARMS assay and Sanger sequencing were 48.0%(49/102)and 32.3%(31/96),respectively(P＜0.05).In biopsy tissue samples,the mutation rate detected by ARMS(57.1%,12/21)was significantly higher than that by Sanger sequencing(23.8%,5/21,P＜0.05),however,there was no significant difference in mutation rate of paraffin embedded specimens between two methods(49.3%,37/75 vs 34.7%,26/75,P＞0.05).According to ARMS results,the EGFR mutation rate was higer in female patients(68.0%)than in male patients(28.8%),in non-smoking patients (65.5%)higher than that in smoking patients(27.7%),in adenocarcinomas(62.3%)higher than that in squamous cell carcinomas (26.8%)(allP＜0.05).The EGFR mutation rate was not correlated with the age and lymphatic metastasis of patients(allP＞0.05).ConclusionThe mutation rates of EGFR 19 and 21 exons were higher in NSCLC patients,especially in non-smoking,female and adenocarinoma patients.Sanger sequencing method has more advantages for large tissue samples,and the ARMS method is more suitable for biopsy and small samples.Therefore,the combination of two methods may provide more reliable and comprehensive test results.

2016-09-09）

（本文編輯：陳麗）

315040 寧波市鄞州人民醫院中心實驗室

王建華，E-mail：wjhua530@163.com