基因芯片技術及其在畜牧獸醫業中的應用概述

陸 曼 李博巖 王旭平 柳誠剛 譚 斌 楊汝才

(貴州大學動物科學學院 貴陽 550025)

1 基因芯片技術的發展歷史

基因芯片(gene chip)亦稱DNA芯片，主要是指通過平面微細加工技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統，用以實現對細胞、核酸、蛋白質及其他生物組分的快速、準確、大信息量檢測。隨著人類基因組計劃(HGP)的實施，基因芯片應運而生，該技術是繼大規模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學技術創新。

基因芯片的原型是在20世紀80年代中期出現的，它依據計算機半導體芯片制作技術中晶體管集成在芯片上這一原理，將寡核苷酸分子集成在芯片上而制成[1～2]。Bains等[3]運用雜交的方法將短的DNA片斷固定在支持物上，并借助雜交原理對其序列進行了測定。基因芯片真正從實驗室走向工業化得益于照相平板印刷技術與探針固相原位合成技術的結合以及激光共聚焦顯微技術。這些技術的引入使數以萬計的高密度探針分子的合成與固定成為可能，而激光共聚焦顯微掃描技術也有可能讓雜交信號的準確、實時、靈敏的檢測和分析成為現實。1990年，美國Affmetrix公司的Fodor等通過實驗把一種光敏材料涂布在硅芯片表面，通過光蝕刻技術原位合成了多肽鏈。在此基礎上，Fodor等進行了技術改進，最終率先合成了DNA陣列。1997年，斯坦福大學Brown實驗室研制出了世界上第一張全基因組芯片。此芯片是酵母全基因組芯片，具有6166個基因，它的研制成功開創了基因芯片技術應用的先河。

1970年以后，隨著基因組學、生物信息學、系統生物學等新興學科的迅猛發展及人們消費觀念的改變，動物育種目標由單一的常規育種向分子與常規聯合育種轉變，肉用性能相關基因的篩選成為研究熱點。基因芯片及熒光定量PCR技術的出現為肉牛肉質性狀的系統研究提供了強有力的手段[1]。

2 基因芯片簡介

2.1 基因芯片的原理 基因芯片是建立在雜交測序技術和基因探針上的一種高效快速的核酸序列分析工具。雜交測序是基因芯片的測序原理。此方法是將大量的基因探針高密度地、有序地排列在一塊1～2 cm2大小的載體上, 隨后用標記的待測樣品與之雜交, 通過分析檢測雜交信號的分布及強度便可以獲得樣品中待測DNA的各種數據。

2.2 基因芯片的類型 基因芯片可以分為三種類型：①用聚合物基片(硝酸纖維膜或尼龍膜等)制成的芯片。這種芯片的核酸探針或cDNA片段被固定在聚合物基片表面上，檢測時同位素標記的靶基因與其雜交，之后采用放射顯影技術進行分析檢測。此方法的優點是可以方便地使用目前分子生物學常用的放射顯影技術及其所需檢測設備，檢測技術比較成熟；缺點是芯片上的探針密度不高，要使用大量的試劑和樣品，不完全適合于定量檢測。②用玻璃板作為探針的載體制成的芯片。這種芯片的DNA探針陣列是用點樣法固定在玻璃板上的，檢測時將熒光標記的靶基因與玻璃板上探針進行雜交，然后檢測雜交分子的熒光數據，便可獲得靶基因的相關資料。這種方法的優點是大大提高了探針的密度，有利于獲得比較高的檢測精度；缺點是批量化和標準化生產方面仍有較多困難。③用玻璃或其他硬質材料薄片作為探針的載體制成的芯片。這種基因芯片的寡核苷酸探針陣列可在載體表面上直接合成，檢測時將熒光標記的靶基因與寡核苷酸探針雜交，并進行后續的熒光檢測，便能獲得靶基因的各種數據。此方法是把DNA化學合成技術與微電子光刻技術相結合，優點是大大提高了基因芯片探針的密度，可以進行規模化生產，有很大的發展空間。

2.3 基因芯片的優點 基因芯片有以下優點[4]: ①使在同一條件和時間下需要多次處理的遺傳分析能快速完成，有很強的類比性；②細胞、組織、血液等的基因表達信號的定量、定性分析可以在同一張芯片上獲得, 并還可以實現時間與空間上、全局檢測靜態到動態的差異及遺傳信息的檢測，有很大的信息產出率；③有較強專一性和高度的敏感性，可以精準和可靠測定10 pg/μL 的DNA 樣品；④尼龍膜制作的微陣列, 可重復進行多達20 次雜交實驗，有很好的重復使用性；⑤已有的芯片面積最小的僅有1 cm2, 最大的也不超過525 cm2，所以每個陣列中DNA樣品的用量較少，反應體積和試劑用量也相應地大大減小, 但反應效率卻提高了百倍，有利于實現測量的自動化和微型化；⑥基因芯片技術容易與其他技術相互交叉使用。

2.4 基因芯片技術的操作流程 生物芯片技術操作流程主要包括四個步驟：①芯片方陣的構建：將玻璃片或硅片作表面處理，并將蛋白質分子或DNA片段按順序排列在芯片上；②樣品的制備：獲取生物樣品中的DNA、蛋白質或RNA并對其做標記，可以大大提高檢測的靈敏度(一般情況下，待測材料不能直接與芯片反應，只有少數的特殊樣品除外)；③生物分子反應：芯片檢測的關鍵是芯片上的生物分子之間的反應，應當選擇最合適的反應條件，使生物分子間反應條件處于最佳狀況，從而使生物分子之間的錯配比率大大降低；④芯片信號的檢測：將芯片置入芯片掃描儀中是常用的芯片信號檢測方法，掃描后便可獲得有關生物信息。

3 基因芯片在畜牧獸醫業中的應用

3.1 牲畜基因表達水平的檢測 對于基因的保守片段設計了多對完全與之匹配的寡核苷酸探針(PM)以及相應的中心單堿基錯配的寡核苷酸探針(MM)，將它們固定在芯片的相鄰位置上，便可用來對標記的樣品靶序列進行雜交探測。陽性情況下(正常完全匹配)，PM的雜交信號明顯強于MM的雜交信號；而假陽性時(錯配)，兩者的雜交信號差異不明顯。所以，PM / MM(PM與MM的信號比值)可作為衡量陽性的指標，當某一基因三條以上探針呈陽性時，可定性判斷閑逛基因的表達。而通過比對異常和正常樣品雜交信號，則可檢測不同樣品中基因表達水平的變動趨勢。

這方面的研究已有不少報道。朱正茂等[2]以杜洛克豬胎兒骨骼肌5個不同發育時期的背最長肌作樣本研究其基因表達譜，并對結果進行聚類分析，獲得了骨骼肌發育的變動信息。Lin等[5]運用由9182個cDNA探針構成的基因表達譜芯片對杜洛克和桃園豬骨骼肌表達譜進行了分析，發現杜洛克豬中與轉率調控蛋白、肌原纖維蛋白、能量代謝酶相關的基因表達上調，解釋了杜洛克在出生后比桃園豬具有更高的肌肉增長率的作用機制。Ushizawa等[6]根據牛肝臟cDNA序列制備了代表2059個牛基因的芯片，并檢測了妊娠牛基因轉錄差異，結果發現在懷孕第27～28 d時大多肝臟基因被誘導表達。Yao等[7]用卵母細胞cDNA文庫建立了基因芯片，為卵泡發育和早期胚胎發育機理的研究提供了有力的工具。張國梁[8]等利用基因芯片技術構建了中國草原紅牛公牛與閹牛差異基因表達譜。

3.2 獸藥篩選和新獸藥的開發 基因芯片技術可以用來鑒定和分離藥物的有效成分，解決了目前獸藥產業開發遇到的重要困難。很多獸藥是直接或者間接地通過改變、修飾動物基因的表達或基因表達產物的功能而生效。所以，可通過基因芯片技術分析動物機體用藥前后的不同器官、組織基因表達的差異，從眾多藥物成分中篩選出真正起作用的組分物質。基因芯片技術在藥物篩選方面有著巨大的優勢，因為該技術具有大規模、高通量、平行性地分析基因表達的能力。利用基因芯片技術作大規模的篩選研究可以縮短藥物篩選所用時間，節約大量的動物實驗，降低風險和費用，大大提高效率。

3.3 畜禽疾病的診斷 伴隨著畜牧業的發展，動物傳染病的流行變得更加復雜，畜禽疾病的診斷和防治也隨之更加困難。傳統的診斷方法雖然可靠，但是每次只能檢測一種病原; 而生物芯片能一次檢測多種病原，而且具有需要樣品量少、特異、靈敏、快速和費用低廉的優勢。

基因芯片在該領域的應用研究的報道很多。美國科羅拉多大學與疾病控制和預防中心研發的“M 基因芯片”，采用流感病毒基因模版，可快速檢測各種流感病毒，其中包括H5N1 型高致病性禽流感病毒，可輕易將H5N1 型禽流感病毒與普通感冒病毒相區分。陳鳳梅等[9]應用RT- PCR或PCR方法分別獲得雞禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎等14 種家禽疾病的病原核酸特異性片斷，并以這些片斷為探針，采用接觸式電樣技術制成低密度的DNA 陣列芯片，同時成功檢測了這14 種禽類傳染病，驗證了該新穎DNA 陣列芯片的良好檢測效果。

3.4 園林觀賞動物的DNA 測序 HGP計劃的實施促進了高效的自動化測序方法的發展，基因芯片利用固定探針與樣品之間分子雜交產生的雜交譜而排列出待測樣品的序列，此測序法比傳統的Sanger雙脫氧鏈終止法快速且前景誘人。

例如，美國Affymetrix 公司于1998 年生產的帶有13.5萬個基因探針的芯片，使人類DNA 的解碼速度比原來提高了25 倍。Mark chee 等[10]用帶有13.5萬個寡核苷酸探針陣列測定了全長為16.6 kb 的人線粒體基因組，其準確率高達99%。Hacia等[11]也曾用含4.8 萬個寡核苷酸的高密度微陣列分析了人與黑猩猩BRCA1 基因序列的不同，發現在該基因外顯子中的部分核酸序列同源性為 83.5%～98.2%之高 ，揭示了兩者在進化上的高度一致性。

3.5 尋找牲畜新基因 研究表明，在序列信息缺乏的條件下，可采用基因芯片技術尋找新基因。Chitko-McKown等[12]研究了牛巨噬細胞基因用脂蛋白(LPS)處理過后表達的變化情況。他們將人的基因芯片與反轉錄的牛巨噬細胞基因的cDNA進行雜交，發現有44個基因的表達存在差異，其中有18個基因是牛的巨噬細胞新基因。Dvorak等[13]在研究豬腸黏膜的派伊爾氏淋巴集結功能的分子機制時采用了基因芯片技術。研究表明在3687個表達序列標簽(ESTs)中出現了2414個特異核苷酸序列，其中至少有371個基因是新基因。Schena等[14]將熱休克作用和佛波酯處理的T 細胞的cDNA與包含1056 個cDNA的芯片雜交, 得到了4個新基因。

3.6 畜禽高產、優質、高抗性等基因的篩選及優良雜種后代選育 畜禽的基因型決定不同性狀的表型，是由單一或眾多基因相互協同作用的結果。畜禽高產、優質等性狀可能是質量性狀也可能是數量性狀。通過分子生物學方法，已經找到了很多由單一基因控制的性狀，但其對于鑒定由多基因控制的多態性變化與畜禽表型的關系，以及發現更多的有用基因則顯得無能為力。通過采用基因芯片技術使快速發現具有重要應用價值的新基因以及研究基因表達的多態性成為可能，為傳統分子生物學研究提供了新的工具和思路。通過制作全基因組芯片，可以在多樣本大群體中快速識別與相關性狀和功能有關的特殊功能基因，從而為物種改良、新品種選育、加快育種進程提供理論基礎。

在育種過程中選擇優良雜種后代，最困難的一步是從大量的雜交組合群體中篩選具有目的基因的優良雜合體或者純合體，從而選育出具有優良性狀或者符合育種目的的目標個體。利用基因芯片技術，可簡化傳統的育種程序，通過制作帶有篩選目的基因的芯片，采集分離出來的畜禽基因，不再需要通過繁雜的辛勤的育種工作和長時間的選擇，就可以實現從雜種后代中篩選出優良個體，并育成新品種的過程。因此，通過基因芯片技術，可以改變傳統育種工作模式，使畜禽遺傳育種工作變得簡單、高效、快速、精確。

李艷華等[15]采用基因芯片技術以及其他相關技術，篩選出了與豬群的鮮肉產品的感觀質量及其加工性狀、胴體組成、脂肪的質量性狀(包括脂肪含量、嫩度、肉色、肌纖維直徑、大理石紋等)等肉質性狀相關的遺傳效應和主基因關聯十分明顯的遺傳標記。

4 展望

基因芯片技術多學科及相關技術融合的結果，已經廣泛用于基因表達研究、基因診斷、發現新基因、基因組研究及各種病原體的診斷等領域。當前，應用該技術成本還比較高，因此推廣應用受到一定的局限。但隨著計算機處理軟件的進一步開發利用，基因芯片技術的不斷發展，基因芯片的成本會越來越低，基因芯片一定會得到越來越多的應用。相信在不久的將來，基因芯片技術一定會成為畜牧業研究的常規手段，為畜牧業發展助力。