風濕痹痛方治療大鼠膠原性關節炎的實驗研究*

梁 衛梁 濤張麗玲沈家敏孫楚楚陳 曄紀永章△

（1.解放軍第四五四醫院，江蘇 南京 210002；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

·實驗報告·

風濕痹痛方治療大鼠膠原性關節炎的實驗研究*

梁 衛1梁 濤2張麗玲1沈家敏2孫楚楚2陳 曄1紀永章1△

（1.解放軍第四五四醫院，江蘇 南京 210002；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

目的 探討風濕痹痛方對類風濕關節炎的治療作用及其初步機制。方法 采用大鼠足部皮內注射牛Ⅱ型膠原乳化劑，建立膠原誘導的關節炎模型（CIA），造模成功后設空白對照組、模型對照組、雷公藤多苷組（7.5 mg/kg）及風濕痹痛方（9.5，19，38 g/kg）3個劑量組，連續給藥14 d。觀察風濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹的治療作用。ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、sFas、sFasL含量的變化；Western Blot法檢測CIA大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）和FLIP的表達。結果 造模14 d后，模型大鼠與正常對照組相比足腫脹明顯，風濕痹痛方可明顯減輕CIA大鼠的足腫脹度。與模型組相比，風濕痹痛方高劑量組大鼠血清中sFas、sFasL含量明顯降低 （P＜0.05）；大鼠滑膜組織Caspase-8表達含量顯著升高 （P＜0.05）。結論 風濕痹痛方對類風濕關節炎具有免疫調節作用，其機制可能與提高Caspase-8的表達同時影響sFas/sFasL介導的滑膜細胞凋亡，促進細胞凋亡，減少關節損傷有關。

膠原性關節炎 風濕痹痛方 大鼠 細胞因子 凋亡

類風濕關節炎（RA）是一個以累及周圍關節為主的多系統性、炎癥性的自身免疫性疾病，表現為滑膜的炎性滲出、細胞浸潤、滑膜增生肥厚、血管翳形成、軟骨及骨組織的侵蝕，導致關節結構的破壞［1］。目前臨床治療以非甾體類抗炎藥、慢作用抗風濕藥、免疫抑制劑為主［2］，雖有療效，但存在毒副作用多、復發率高等問題，所以本病的治療一直是困擾醫學界的難題之一［3］。中醫、中西醫結合治療RA的優越之處已日益顯現，研究中醫藥對RA的作用機理日益受到關注。本研究通過建立牛Ⅱ型膠原誘導的關節炎大鼠模型（CIA），觀察風濕痹痛方對膠原性關節炎大鼠的治療作用，并初步探討其可能機制，進一步為其臨床應用提供實驗依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠，體質量200～250 g，由揚州大學實驗動物中心提供。合格證：SCXK （蘇）2012-0004。

1.2 試劑與儀器 風濕痹痛方（南京中醫藥大學提供，批號201601）；牛Ⅱ型膠原（Chondrex公司，批號20021）；雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司，批號150108）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號SLBJ9001V）；冰乙酸（南京化學試劑有限公司，批號12011910106）；大鼠sFAS配體酶聯免疫分析試劑盒 （上海源葉生物科技有限公司，批號20160415）；大鼠sFAS酶聯免疫分析試劑盒 （上海源葉生物科技有限公司，批號20160415）；大鼠TNF-α酶聯免疫分析試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司，批號20160105）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號20151216）；Caspase-8一抗 （武漢博士德生物工程有限公司，批號1731243）；TNF-α一抗 （武漢博士德生物工程有限公司，批號ZP333BP33）；FLIP一抗 （北京博奧森生物技術有限公司，批號20151228）；IL-1β一抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號20151228）。離心機（上海盧湘儀儀器有限公司）；電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標儀（美國Bio-Tek儀器有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）

1.3 模型制備［4-5］取適量牛Ⅱ型膠原，加入0.1 mol/L的冰乙酸，4℃搖床震蕩過夜，質量濃度為8 mg/mL，再按1∶1加入弗氏完全佐劑充分混合乳化，制成Ⅱ型膠原蛋白乳化劑，最終質量濃度為4 mg/mL，4℃冰箱保存備用。取雄性Wistar大鼠，右后足拓皮內注射0.1 mL膠原蛋白乳化劑。同時，另設空白對照組，相同部位注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4 分組及給藥 取造模成功Wistar大鼠50只，隨機分為5組：模型組、雷公藤多苷片組（7.5 mg/kg）、風濕痹痛方低、中、高劑量組（9.5，19，38 g/kg）各10只。取注射0.9%氯化鈉注射液大鼠10只，作為空白對照。致炎第14天開始，各組灌胃給予相應質量濃度藥液，每天1次，連續給藥14 d。空白組和模型組給予等體積（10 mL/kg）0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標本采集與檢測 1）足腫脹度測定［6］。分別檢測造模前和給藥后各組大鼠左后足腫脹程度，求出足腫脹度 （足腫脹度=給藥后足周長-造模前足周長）。2）ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、sFas、sFasL的含量。末次給藥后，各組大鼠10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，固定，腹主動脈取血，以3000 r/min離心10 min，取血清，-20℃保存備用。采用TNF-α、sFas、sFasL試劑盒測定其含量。3）Western Blot法檢測滑膜組織TNF-α、IL-1β、Caspase-8和FLIP的表達［7-8］。末次給藥后，各組大鼠10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，取出滑膜組織，制備滑膜組織勻漿，提取組織蛋白。將蛋白進行SDS-PAGE轉移至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉室溫條件下搖床上搖動封閉2 h。4℃孵育一抗過夜［IL-1β和FLIP以1∶500，TNF-α按1∶1000、半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）按1∶400，加入BCA稀釋］，洗滌3次，每次10 min，后將膜置于1∶10000稀釋的二抗稀釋液中，室溫振蕩孵育1~1.5 h。孵育結束后，漂洗濾膜3次，每次15 min。將膜置于凝膠成像系統曝光體系中，均勻滴加ECL混合液，曝光。采用凝膠成像系統軟件對顯影結果進行分析，計算目的條帶相對表達量（相對表達量=目的條帶表達量/內參表達量）。

2 結 果

2.1 風濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹度的影響 見表1。末次給藥后，檢測風濕痹痛方對大鼠足腫脹度的影響。由表1可見，CIA大鼠各組足腫脹度與模型組相比具有降低趨勢，其中，風濕痹痛方高劑量組和雷公藤多苷片組與模型組相比存在顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01）。提示風濕痹痛方能改善大鼠足腫脹度。

表1 風濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹度的影響（cm，）

表1 風濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹度的影響（cm，）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別 n空白組 10模型組 10雷公藤多苷片組 10腫脹度0.14±0.05**0.78±0.09 0.38±0.19**風濕痹痛方高劑量組 10 0.48±0.18*風濕痹痛方中劑量組 10 0.60±0.14風濕痹痛方低劑量組 10 0.63±0.24

2.2 風濕痹痛方對CIA大鼠血清TNF-α、sFas、sFasL含量的影響 見表2。模型組大鼠血清中sFas、sFasL含量明顯高于正常對照組（P＜0.05），與模型組相比，雷公藤多苷片組和不同劑量風濕痹痛方組大鼠血清中的sFas、sFasL含量均有降低趨勢，其中雷公藤多苷片組和風濕痹痛方高劑量組sFas、sFasL含量明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤多苷片組和不同劑量風濕痹痛方組大鼠血清中的TNF-α均無統計學差異（P＞0.05）。提示風濕痹痛方通過調節sFas/sFasL含量促進細胞凋亡，從而減輕關節炎癥反應。

表2 風濕痹痛方對CIA大鼠清細胞因子的影響（ng/L，）

表2 風濕痹痛方對CIA大鼠清細胞因子的影響（ng/L，）

組別 n空白組 10模型組 10雷公藤多苷片組 10風濕痹痛方高劑量組 10風濕痹痛方中劑量組 10風濕痹痛方低劑量組 10 sFas sFasl TNF-α 72.91±6.37*66.71±10.87*98.86±15.23 84.93±12.95 106.01±31.44 124.52±26.56 65.41±1.87*67.45±3.15*102.64±19.62 64.61±3.81**68.61±2.30*122.30±16.34 78.32±13.16 81.87±14.22 125.61±21.47 81.17±11.36 93.61±27.27 122.95±21.19

2.3 風濕痹痛方對CIA大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、caspas-8、FLIP表達的影響 見表3。與模型組相比，各組CIA大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β和FLIP表達含量無明顯差異 （P＞0.05）；Caspase-8的表達呈上升趨勢，其中風濕痹痛方高劑量組、雷公藤多苷片組大鼠滑膜組織Caspase-8的含量較模型組顯著升高 （P＜0.05）。提示風濕痹痛方能提高Caspase-8的表達，誘導細胞凋亡，減輕關節炎癥反應。

表3 各組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、Caspas-8、FLIP表達的影響（）

表3 各組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、Caspas-8、FLIP表達的影響（）

組別 n空白組 10模型組 10雷公藤多苷片組 10風濕痹痛方高劑量組 10風濕痹痛方中劑量組 10風濕痹痛方低劑量組 10 Caspase-8 TNF-α 1.06±0.15*1.29±0.17 0.24±0.18 1.30±0.93 0.70±0.09*1.15±0.30 0.83±0.20*1.34±0.40 0.63±0.18 0.67±0.38 0.30±0.14 0.98±0.22 IL-1β FLIP 0.58±0.24 0.72±0.14 0.63±0.22 0.82±0.29 1.74±0.85 0.79±0.14 1.68±0.63 0.91±0.32 1.54±0.56 0.74±0.26 0.78±0.15 0.76±0.15

3 討 論

類風濕關節炎屬于中醫學“痹證”的范疇［9］，主要病機為肝腎虧虛、風寒濕邪外侵、化毒內郁、氣滯血瘀、痰瘀阻絡，我們針對這一病機特點擬制了風濕痹痛方，具有祛風散寒除濕、解毒化痰、行氣止痛、祛瘀通絡、補益肝腎的作用。前期臨床觀察發現風濕痹痛方治療類風濕性關節炎有較好的療效。

類風濕關節炎（RA）是以關節滑膜慢性炎癥為主要表現的自身免疫性疾病，其顯著的病變以滑膜組織炎性細胞浸潤、滑膜細胞增生、關節軟骨及軟骨下骨質破壞為主要病理表現。目前已有多種動物模型用于RA的研究，但與RA免疫反應和病理改變等方面最為相近的是膠原誘導性關節炎（CIA）模型，此模型也是篩選和研究治療RA藥物的理想模型［10］。故本試驗采用了牛Ⅱ型膠原誘導大鼠CIA模型來探討風濕痹痛方治療類風濕性關節炎的療效和部分作用機制。大鼠造模14 d后，開始出現關節炎癥狀，表現為雙側后足拓部腫脹。實驗結果表明，風濕痹痛方能明顯降低CIA大鼠的足腫脹度，對大鼠膠原性關節炎具有明顯抗炎消腫作用。

研究結果表明，滑膜組織滑膜細胞的持續活化和增生導致的關節損傷與Fas/FasL系統凋亡障礙有關［11-12］。細胞凋亡是一個影響免疫細胞和靶細胞的多步驟的復雜過程，需要多種細胞內和細胞外信號及多種基因產物的相互作用［13］，其中最主要的是有關Fas/ FasL凋亡系統的研究。sFas與FasL有很高的親和力，因其缺乏死亡區，不具備生物活性，可以通過與膜Fas竟爭結合FasL而抑制Fas介導的細胞凋亡。sFasL同樣對Fas誘導的凋亡起抑制性調節［14］。Fas與FasL結合，形成死亡誘導復合物，與Caspase-8酶原的死亡區域結合，進一步使Caspase-8前體蛋白活化為Caspase-8，啟動Caspase級聯反應，激活下游Caspase-6、Caspase-7、Caspase-3，最終導致細胞凋亡［15］。實驗結果表明，風濕痹痛方能上調Caspase-8的表達，明顯降低sFas、sFasL水平，促進細胞凋亡，減少滑膜炎癥，減輕關節損傷。

綜上所述，風濕痹痛方對類風濕性關節炎具有免疫調節作用，其機制可能與提高Caspase-8表達的同時影響sFas/sFasL介導的滑膜細胞凋亡，促進細胞凋亡，減少關節損傷有關。

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Study on Fengshi Bitong Prescription in the Treatment of Rats with Collagen-induced Arthritis

LIANG Wei，LIANG Tao，ZHANG Liling，et al.

The Department of Traditional Chinese Medicine of No.454 Hospital of PLA，Jiangsu，Nanjing 210002，China.

Objective：To discuss the therapeutic effects and preliminary mechanism of Fengshi Bitong（FSBT）prescription on treatment of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Rats were given foot intradermal injection of bovine type collagen emulsion to establish collagen-induced arthritis（CIA）model.After successful modelling，they were randomly divided into 6 groups：normal control group；CIA model group；tripterygium glycosides group（7.5 mg/kg）；FSBT groups（9.5，19，38 g/kg），and were continuous administered for 14 days.The effect of FSBT on paw edema was observed.Serum levels of TNF-α，sFas，sFasL were detected by ELISA.Expression of TNF-α，IL-1β，caspase-8 and FLIP of CIA rats′synovial tissue were detected by Western Blot.Results：In model group，the paw edema was significant compared with normal control group，and FSBT could significantly reduce the paw edema.The serum levels of sFas，sFasL in FSBT high dose group（38 g/kg）were significantly decreased（P＜0.05）compared with CIA model group.Expression of caspase-8 was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：FSBT may have immune regulation effects on rheumatoid arthritis.Its mechanism may be related to increasing the expression of caspase-8 and affecting apoptosis of synovial cell，which is mediated by sFas/sFasL.

Collagen-induced arthritis；Fengshi Bitong prescription；Rats；Cytokine；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0083-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.025

2016-09-19）

解放軍第四五四醫院課題資助項目（12YY003）

△通信作者（電子郵箱：jyz454@sohu.com）