抗膠質瘤Ⅰ號方對腦膠質瘤細胞侵襲性的影響

劉春玲+唐明科+秦麗娟

【摘要】 目的：探討抗膠質瘤Ⅰ號對膠質瘤細胞侵襲性降低的作用及其與PI3K/PKB信號傳導通路之間的關系。方法：MTT法檢測抗膠質瘤Ⅰ號處理培養的C6膠質瘤細胞的抑制率，免疫印跡法檢測腫瘤細胞內PI3K和PKB表達水平，最后，利用結晶紫染色法檢測Transwell下室面的膠質瘤細胞數。結果：抗膠質瘤Ⅰ號可以抑制PI3K和PKB蛋白表達水平，抗膠質瘤Ⅰ號作用0.5 h時PI3K蛋白表達水平最低為（25.1±3.1），作用1 h時PKB蛋白表達水平最低為（25.1±3.8），與對照組的（99.1±1.6）、（91.2±3.5）比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。而抗膠質瘤Ⅰ號作用3 h時對膠質瘤細胞的抑制程度最大，抑制率為（91.2±5.7）%，與對照組的（68.0±5.2）%比較，差異有統計學意義（P<0.01）。且此時Transwell下室面的細胞數最少，為（1.4±0.4）×106個，與對照組的（35.6±2.7）×106個比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：抗膠質瘤Ⅰ號可能是通過抑制PI3K/PKB而抑制膠質瘤細胞的增殖，從而引起膠質瘤細胞侵襲性的降低。

【關鍵詞】 膠質瘤； 抗膠質瘤Ⅰ號； PI3K/PKB信號傳導通路

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions on reducing the invasiveness of glioma cells，and the relationship between Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions and PI3K/PKB signal transduction pathway.Method：MTT method was used to detect cell inhibition rate of C6 glioma cells which was treated by the Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions，the expression level of PI3K and PKB in tumor cells was detected by Western blot，in the end，the number of glioma cells in Transwell was detected by crystal violet staining method.Result：Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions can inhibit PI3K and PKB protein expression level，the expression level of PI3K protein was the lowest （25.1±3.1） when the effect of Resistance to Glioma Ⅰ was 0.5 h，and the lowest level of PKB protein expression was （25.1±3.8） at the effect of Resistance to glioma Ⅰ was 1 h，compared with the control group （99.1±1.6），（91.2±3.5），the differences were statistically significant（P<0.05）.While the largest inhibition rate appear at 3 h after Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions，inhibition rate was （91.2±5.7）%， compared with （68.0±5.2）% in control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.At the same time，the glioma cell number on transwell chamber surface was the least（1.4±0.4）×106，compared with（35.6±2.7）×106 in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions may is through the inhibition of PI3K/PKB signal transduction pathway and inhibit the proliferation of glioma cells，thereby reducing the invasiveness of glioma cells.

【Key words】 Glioma； Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions； PI3K/PKB signal transduction pathway

First-arthors address：The Second Hospital of Chifeng，Chifeng 024000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.004

在中樞神經系統腫瘤中，膠質瘤是最為常見的[1-3]。而對于膠質瘤的治療，除了大家廣為熟悉的手術治療以外，還往往在術后進行相應的放、化療等輔助治療[4-5]。這是由于膠質瘤侵襲性高，而手術只能切除成型的病灶，已經侵襲到遠處的膠質瘤細胞不易發現也做不到全部清除，因此術后膠質瘤患者往往復發率極高。抗膠質瘤Ⅰ號方中的部分成分已經應用于臨床其他腫瘤的治療并取得了一定的效果，文獻[6]研究發現，抗膠質瘤Ⅰ號具有抗膠質瘤作用，但其確切的分子生物學作用機制尚不十分清楚。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）C6大鼠腦膠質瘤細胞株由中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心提供。（2）主要試劑羊抗大鼠PI3K和PKB購自英國Abcam公司，小鼠抗大鼠β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。抗膠質瘤Ⅰ號組成成分包括鴉膽子口服液、白花蛇草、蜈蚣、水蛭、枸杞子、土茯苓、豬苓、葛根。

1.2 方法

1.2.1 膠質瘤細胞培養 膠質瘤細胞采用F-12培養基培養進行培養，培養基內加入2.5%胎牛血清和15%馬血清，37 ℃孵箱內孵育，并通以5%的CO2。細胞生長至對數生長期后，隨機分為實驗組和對照組。實驗組為抗膠質瘤Ⅰ號作用0.1、0.5、1、2、3、4 h 六個時間點，對照組在相應的時間點加入等量生理鹽水，每組選10個標本。

1.2.2 免疫印跡法檢測膠質瘤細胞內的PI3K和PKB蛋白表達水平 培養的膠質瘤細胞給予抗膠質瘤Ⅰ號后，收集不同時間點（0.1、0.5、1、2、3、4 h）的膠質瘤細胞，細胞進行裂解、超聲破碎后，低溫離心并收集上清液，采用7.5%的SDS-PAGE進行電泳，每個泳道樣本的加樣量為30 μg。半干轉印結束后用脫脂奶粉封閉1 h后并4 ℃過夜。次日取出NC膜分別加入PI3K和PKB的一抗震蕩孵育2 h。TTBS洗后行二抗震蕩孵育1 h。TTBS洗后的NC膜采用增強化學發光檢測，結果用IDV值進行分析。

1.2.3 抗膠質瘤Ⅰ號對腫瘤細胞增殖的影響 培養的膠質瘤接種于96孔板，密度調整為1×104個細胞/孔，細胞增殖至對數生長期24 h后，細胞培養液內加入抗膠質瘤Ⅰ號，對照組加入不含血清的培養基。MTT染色法檢測抗膠質瘤Ⅰ號作用后不同時間點的膠質瘤細胞增殖抑制率。

1.2.4 結晶紫染色法檢測膠質瘤侵襲性 Transwell膜上室接種膠質瘤細胞，密度為5×104個/膜，培養24 h后，分別于抗膠質瘤Ⅰ號作用后不同時間點用測定Tanswell膜下室面的貼壁細胞數目。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統計學處理，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞內PI3K的表達水平 抗膠質瘤Ⅰ號處理后的膠質瘤細胞，PI3K的表達水平降低，于抗膠質瘤Ⅰ號處理后的0.5 h時達最低為（25.1±3.1），與對照組的（99.1±4.2）比較，差異有統計學意義（P<0.01），其后隨時間PI3K的表達水平逐漸增高，見圖1。

2.2 膠質瘤細胞內PKB的表達水平 抗膠質瘤Ⅰ號處理后，膠質瘤細胞內PKB的表達水平降低，并于抗膠質瘤Ⅰ號處理后的1 h時達最低（25.1±3.8），與對照組的（99.4±3.1）比較，差異有統計學意義（P<0.05），其后PKB的表達水平逐漸增高，見圖2。

2.3 抗膠質瘤Ⅰ號對膠質瘤細胞增殖的影響 抗膠質瘤Ⅰ號處理作用于膠質瘤細胞后，選取抗膠質瘤Ⅰ號作用0.1、0.5、1、2、3、4 h六個時間點的膠質瘤細胞，每個時間點選取10例標本，分別觀察抗膠質瘤Ⅰ號作用于膠質瘤后的不同時間點引起膠質瘤細胞抑制率的變化。結果發現，抗膠質瘤Ⅰ號作用于膠質瘤細胞后，隨時間延長，抑制率開始增大，于3 h時抑制程度最大，其后又隨時間的延長而降低。其中，抗膠質瘤Ⅰ號作用于膠質瘤細胞后的2、3 h時，其抑制率分別為（68.0±5.2）%和（91.2±5.7）%，與對照組的（9.5±1.5）%、（9.4±2.1）%比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.4 抗膠質瘤Ⅰ號對膠質瘤細胞侵襲性的影響 抗膠質瘤Ⅰ號可使得侵入transwell下室的細胞數量減少，于處理后的3 h時明顯降低，提示抗膠質瘤Ⅰ號可降低膠質瘤侵襲性，并且于抗膠質瘤Ⅰ號作用3 h時降至最低，侵襲細胞數為（1.4±0.4）×106個，與對照組的（35.6±2.7）×106個比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖3。

3 討論

神經膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，近年來，神經膠質瘤發病率有逐年升高的趨勢，且其發病群體也日趨年輕化[7-8]。膠質瘤的臨床主要表現為一系列的腦組織壓迫癥狀。在臨床上，膠質瘤的治療依然以手術為首選。但因膠質瘤高侵襲性的特點，使得手術無法做到病理學上的徹底清除。因此，即使患者術后短期效果明顯，但很快又會復發，嚴重影響了膠質瘤患者的生活質量和生命周期[9]。為了最大程度減少或消除膠質瘤復發的概率，膠質瘤患者術后通常均輔助放射治療或化學治療，但這兩種治療方法同時又會產生大的副作用，因此，效果往往差強人意。隨著中醫中藥的研究進展，臨床上中醫中藥治療腦瘤的成功報道亦日趨增多[10-12]。在很多臨床與實驗研究中發現，中醫中藥確實可以控制患者的疾病發展與轉歸，可以減少由放、化療造成的不良反應，提高患者的生活質量和生存周期。

腦膠質瘤的中醫病機主要可分為以下幾個方面，（1）痰濕內阻型：痰濕之邪長久不化，彈性重濁黏膩，凝聚于腦，脈絡受阻，形成腫塊，阻塞清竅。在其病變過程中，腦絡痹阻日久，化熱動風，風火相煽，耗傷陰液，致頭痛嘔吐，昏花復視，肢體偏癱，甚則昏迷不醒，抽搐癲癇。（2）氣滯血瘀型：顱內脈絡受阻，邪毒積聚，損傷正氣，不化之食、不去之濕日久演變成痰濁積聚，久而瘀血內生，氣血耗損，經脈阻滯，形成腫瘤。（3）肝腎陰虛型：腎主骨，骨生髓，腦為髓海，處頭部巔頂清虛之地，腎虛可致髓海空虛，邪易乘虛而入。在疾病治療過程中，中醫學強調整體觀念，其重在調整機體陰陽、氣血、臟腑功能平衡，并因人而異采取標本兼治、扶正祛邪的治療原則，借此達到提高患者生命周期和生活質量的目的。目前的研究已經發現，抗膠質瘤Ⅰ號方劑中的很多成分對抗腫瘤有很好的臨床療效[13-15]，但抗膠質瘤Ⅰ號方劑發揮作用的具體機制尚不十分明了。endprint

近年來，關于中草藥及其活性成分抗膠質瘤作用的研究已經證實，人參皂甙、紫杉醇、氧化砷、苦參堿、欖香烯、丹參酮等多種中藥以及合劑對抗膠質瘤的作用機制主要包括：影響膠質瘤細胞周期；抑制癌發生相關基因的表達；調節機體免疫功能；抑制腫瘤血管生長；誘導腫瘤細胞分化；調節腫瘤細胞信號傳導；抑制端粒酶活性和細胞毒作用等[16-18]。中藥誘導膠質瘤細胞凋亡是通過多靶點、多途徑、多環節來實現的。

筆者通過研究抗膠質瘤Ⅰ號對膠質瘤細胞侵襲性、細胞增殖情況，發現抗膠質瘤Ⅰ號方劑可以降低膠質瘤細胞侵襲性，并于抗膠質瘤Ⅰ號作用3 h時最為明顯。而抗膠質瘤Ⅰ號對膠質瘤細胞增殖的抑制作用亦于作用3 h時達最高水平。說明抗膠質瘤Ⅰ號可抑制膠質瘤細胞增殖，降低膠質瘤侵襲性。

有研究發現，PI3K/PKB信號通路在機體生命活動過程中的很多方面發揮著重要作用，且常常可被多種腫瘤所激活[19-20]，與腫瘤的發生、發展、轉移、耐藥性等密切相關[21]。PKB是PI3K的一個重要下游信號分子，可促進細胞惡性轉化。

本研究發現，抗膠質瘤Ⅰ號可以降低PI3K信號蛋白的表達，并于抗膠質瘤Ⅰ號作用后的0.5 h時達最低水平，而信號蛋白PKB則在抗膠質瘤Ⅰ號作用后1 h時達最低表達，據此推測，抗膠質瘤Ⅰ號作用于膠質瘤細胞后，可能是通過降低PI3K的表達而激活了其下游的信號分子PKB，通過此信號通路的激活最終引起膠質瘤細胞增殖受抑降低了膠質瘤的侵襲性。

有關抗膠質瘤Ⅰ號降低膠質瘤侵襲性的作用，可能還有其他的信號通路或信號蛋白分子參與其中，亦可能是調動了機體某些內在機制而實現的，這些尚待進一步研究。

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（收稿日期：2016-10-16） （本文編輯：張爽）endprint