光強和光照時間對大腸桿菌光動力滅菌效果的影響

嚴金華,楊 晨,李澤林,施俊宇,許周速

(浙江工業大學 理學院，浙江 杭州 310023)

光強和光照時間對大腸桿菌光動力滅菌效果的影響

嚴金華,楊 晨,李澤林,施俊宇,許周速

(浙江工業大學 理學院，浙江 杭州 310023)

為獲得光動力滅菌最佳效果，改變光強和光照時間兩個光劑量參數，通過對比實驗獲得最佳滅菌效果時的光劑量.以質量濃度為0.1 mg/mL甲苯胺藍為光敏劑，滅菌光源為中心波長為660 nm、功率為200 mW的激光二極管，大腸桿菌為試驗菌種，通過細菌平板菌落計數法對比獲得滅菌效果.實驗發現對大腸桿菌具有滅菌效果，且滅菌效果受光強和光照時間兩個光劑量參數的影響，隨光強的增強和光照時間的延長，滅菌效果呈現先提高后略有下降，得到光動力滅菌效果存在最佳照射時間和光強的結論.

光動力滅菌；甲苯胺藍；大腸桿菌

光學技術應用于生物、醫藥等學科是一個新興的交叉研究領域，比如改善光催化特性[1]與用于環境測量的光纖折射率傳感[2].光動力滅菌(Photodynamic disinfection)的基本原理是：選擇對細胞具有選擇性的光敏劑(Photosensitizer, PS)，使其在目標細菌周圍或內部聚集，在合適光源照射下引發光化學反應，光敏劑從基態經壽命極短的單線態帶間穿越到三線態這一高能態，處于高能態的光敏劑能級躍遷產生自由基或者單線態氧1O2，上述過程產生的單線態氧或自由基可以與細胞或微生物的磷脂、核酸和蛋白質等生物大分子反應，破壞生物膜結構或其他功能單位，使細胞或微生物死亡[3-4].

采用光動力滅菌方法治療疾病的方法稱為光動力療法(Photodynamic therapy, PDT)或者光動力抗菌藥物療法(Photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT).光動力滅菌技術最早起源于“一戰”前，“一戰”中采用該方法挽救了許多生命.但隨著“抗生素時代”的到來，光動力滅菌技術沒有得到重視，直到近年來“超級細菌”出現及病菌耐藥性問題凸顯，研究一種有效的且不易產生耐受性的方法十分有必要，因此有關光動力滅菌法的研究再次被廣泛開展.國內唐姝姝等[3]研究亞甲基藍對大腸桿菌的殺傷作用，得出的結論為亞甲基藍對革蘭氏陰性腸出血性大腸桿菌有非常明顯的光滅活效果.此外，研究發現二氧化硅納米粒對大腸桿菌也具有較好的殺菌作用[4].

1 實驗目的及準備

光動力技術是一種藥械聯用的技術，涉及到給藥和光照兩個過程，影響光動力滅菌效果取決于兩個方面：一是光敏劑藥物的有效性，包括藥物靶向性、在一定的光劑量激發下自由基或者單線態氧的產生效率；二是激發光敏劑的光源及光源參數.國內外針對影響滅菌效果的原因開展了研究，如有研究者提出細菌細胞壁對光敏劑吸收而對滅菌效果的影響[5-6]，革蘭氏陰性菌具有復雜的細胞壁結構，屏蔽了單重態氧和細胞膜的有效結合，從而降低了滅菌作用.由于光動力滅菌技術多數研究人員的學科背景為醫學或藥物研究人員，因此目前絕大多數關于光動力滅菌的研究主要是針對光敏劑的研發及與生物體相關實驗，較少涉及光源的使用問題.

在光劑量的問題上，目前國內外的研究者大多采用經驗劑量[7-8]，人們直觀的感覺，光強越強或者光照時間越長，對滅菌效果的提升應當是有效的，然而，事實并非如此.從光學角度出發，利用實驗方法，以獲得最優滅菌效果時所需要的光強和光照時間，從而獲得光動力滅菌最佳效果時所需要的光強和光照時間兩個光劑量參數.為此，進行3組對比實驗，分別是加入光敏劑情況下的光照和不用光照、相同光強情況下的不同光照時間和相同光照時間情況下的不同光照強度，以獲得光動力滅菌最佳效果時所需要的光強和光照時間兩個光劑量參數.

2 實驗材料

甲苯胺藍是一種能有效對抗多鐘微生物的光敏劑，其作為光敏劑的光動力療法在殺滅病原微生物方面有很多優勢，它能立刻與微生物結合，幾分鐘之內就可以進行光照滅菌，不需要在病灶處保持長時間的高質量濃度[9-10].實驗以質量濃度為0.1 mg/mL甲苯胺藍為光敏劑，滅菌光源為中心波長為660 nm、功率為200 mW的激光二極管，大腸桿菌為試驗菌種，通過細菌平板菌落計數法對比獲得滅菌率.實驗所用材料如下：

1) 實驗菌種采用大腸桿菌菌株(浙江工業大學生環學院提供)，主要基于以下兩點考慮：一是大腸桿菌代謝類型是異養兼性厭氧型，即在有氧和無氧環境均能活動，對細菌培養要求較低；二是大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，對這類菌種研究單位較多，比較容易獲取菌株.

將活化的大腸桿菌接種到液體培養基中，37 ℃培養至對數生長期，將細菌懸濁液取出，用分光光度計測出OD600=0.05(108CFU/mL左右)，此時細菌形狀穩定，且具有活力.

2) 光敏劑采用甲苯胺藍(Toluidine blue O，TBO)(上海晶純生化科技股份有限公司)，粉末平均相對分子質量為305.82，用去離子水將其配置成高質量濃度母液，并按比例稀釋成不同質量濃度，避光保存，備用.經分光光度計(島津UV2550)測量，其峰值吸收波長為663 nm.

3) 光源采用光源為中心波長為660 nm、最大出光功率為200 mW的激光二極管(Laser diode, LD)，光源波長選擇主要考慮光敏劑的吸收波譜與光源的波長相匹配的問題，實驗選用660 nm正好處于TBO的強吸收峰范圍內.

4) 采用激光二極管控制器(ILX LightWave LDC-3990)控制光功率.利用透鏡對出光光束進行聚焦，根據焦距和光束參數，獲得光束尺寸最小處的面積，并確保光照時光束尺寸最小處照在細菌溶液內，即光照面積不變，而通過控制光功率達到改變光照強度的實驗目的.

5) LB液體培養基和LB計數培養基(購自青島海博生物技術有限公司).LB液體培養基用于大腸桿菌培養，LB計數培養基用于平板菌落計數.

3 實驗結果及分析

為了獲得最優滅菌效果時所需要的光強和光照時間，進行3組對比實驗，分別是加入光敏劑情況下的光照和不用光照、相同光強情況下的不同光照時間和相同光照時間情況下的不同光照強度，通過實驗得到光照強度、光照時間分別與滅菌率的關系，進而獲得光動力滅菌最佳效果時所需要的光強和光照時間兩個光劑量參數.

3.1 有無光照對滅菌效果的影響

首先進行光滅菌效果影響的實驗.將制備好的大腸桿菌懸液各取2 mL分別放入3個試劑瓶中，第1和第2個瓶中分別加入0.1 mg/mL的甲苯胺藍溶液100 μL，第3個試劑瓶不加入甲苯胺藍也不進行光照，作為對照組.3個瓶都避光孕育10 min后，取出第1試劑瓶進行光照實驗，使細菌溶液處于光束照射下，通過設定驅動器的時間設置使光照時間為60 s，控制LED的電流控制輸出光功率，根據光束面積估算，使光強約為200 mW/cm2.

光照實驗結束后，用移液器分別從3個瓶中取出0.5 mL細菌量溶液，分別滴入LB瓊脂培養皿，并放入37 ℃培養環境中分別進行培養，采用平板菌落計數法統計，得到3個瓶中每毫升中菌落單位數分別為的N1，N2和N，其中N為對照組中的細菌菌落數.細菌滅菌率計算公式為

式中：N為對照組每毫升中菌落單位數；Nx為實驗組每毫升中菌落單位數.

無光照和有光照射條件下的對比實驗數據如表1所示.

表1 有無光照情況下的滅菌率

由表1看出：加入光敏劑而沒有光照的情況下，對大腸桿菌也有滅活作用.這是由于甲苯胺藍通常用作細胞染料，可以為細胞著色，但作為堿性燃料，其對細胞具有一定的滅活作用，但滅菌效率僅為24%，顯著低于經過光照后的76.4%.結果表明：光照會使得光敏劑產生活化，從而提高光敏劑對大腸桿菌的殺滅能力.

3.2 光照時間對滅菌效果的影響

實驗過程和步驟與3.1類似，即將制備好的大腸桿菌懸液各取2 mL分別放入5個試劑瓶中，分別加入0.1 mg/mL的甲苯胺藍溶液100 μL，避光孕育10 min后，將其中4個試劑瓶進行光照實驗，設置光照時間分別為0，30，60，90 s，第5個作為對照組.光強對比實驗同樣采用控制變量法，將光強度固定為50 mW/cm2，改變光照時間的長度.測得的數據如表2所示.

表2 不同光照時間的滅菌率

由表2可知：當光敏劑質量濃度保持不變，并保持光強不變，在光照時間由短變長的過程中，滅菌效率先是呈現增長的趨勢，然后在75%～80%之前趨于穩定，當時間持續增長時又會出現明顯的下降.說明甲苯胺藍在光強50 mW/cm2的情況下，對大腸桿菌的殺滅效率峰值出現在光照60 s左右，滅菌效率接近80%.這與人們的常規認識不同，即存在一個最佳照射時間，并非時間越長越好.

該結果出現的非常重要的一個原因是：光照不僅激發光敏劑產生自由并殺滅細菌，同時光照也對細菌液有一定的加溫作用，而該光動力滅菌實驗是在室溫情況下進行，光照而導致的適當升溫使得溫度更接近于細菌適宜繁衍的溫度，反而更有助于細菌生長，故存在最佳照射時間.

3.3 光強對滅菌效果的影響

將制備好的大腸桿菌懸液各取2 mL分別放入5個試劑瓶中，分別加入0.1 mg/mL的甲苯胺藍溶液100 μL，避光孕育10 min后，將其中4個試劑瓶進行光照實驗，設置光照強度分別為10，18，50，200 mW/cm2，第5個作為對照組.光強對比實驗采用控制變量法，將光照時間固定為60 s，改變激光器功率以改變光強，測得的數據如表3所示.

表3 不同光強的滅菌率

由表3可知：光照時間一定時，隨著光強度的增加，滅菌先是呈現上升趨勢，當光強到達一定強度后，繼續增大光強度，滅菌效率不會出現大的變化，說明當光強達到一定強度以后，光強不再與滅菌效率呈正相關趨勢.也就是說，存在一個臨界光強度值，當光強超過該臨界值，對提高滅菌效率并沒有大的提升，說明通過增大光照強度以提高滅菌率是沒有意義的，該結果對于將光動力治療法應用于臨床具有重要意義，不僅對于光治療儀的光源選擇更加寬泛，即無需選用功率超大型的光源，降低了對散熱的要求，而且對降低患者治療時的不舒適度也大有益處，因為大功率光源在靠近人體時所帶來的熱量會讓人感覺不適.

4 結 論

以甲苯胺藍為光敏劑、紅光激光二極管為滅菌光源、大腸桿菌為試驗菌種，采用細菌平板菌落計數法獲得各種情況下的滅菌率，實驗發現，利用方法可以實現光動力滅菌，且滅菌率隨光照時間呈現先提高后下降的趨勢，同時隨光強的增強呈現先提高后略有下降的趨勢，表明滅菌率并非隨著光劑量的提高而單調提高.分析原因，光照產生的熱可能是一個重要因素，光照的增強和光照時間的加長給而產生額外的熱量，加快了細菌繁殖速度，在一定程度上抵消了滅菌進程.

本文得到浙江工業大學優秀課程建設項目(YX1318)的資助.

[1] 何志橋,韓晶,宋爽.Ag修飾TiO2催化劑紫外光催化還原CO2的研究[J].浙江工業大學學報,2014,42(1):20-26.

[2] 周寒青,隋成華.環境折射率變化對納米線光纖場強分布的影響[J].浙江工業大學學報,2011,39(2):228-230.

[3] 唐姝姝,唐書澤,李紅愛,等.亞甲基藍對大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機理[J].食品與發酵工業,2012(7):68-72.

[4] 郭輝,孫瓊,錢俊青.二氧化硅納米粒殺菌性能試驗[J].浙江工業大學學報,2013,41(6):610-613.

[5] 王鈺鋮,顧瑛,黃乃艷.光動力滅菌研究進展[J].中國激光醫學雜志,2012(2):122-129.

[6] 彭瑩瑩,葛海燕.光動力抗菌化學療法治療難治性細菌感染性疾病的研究進展[J].中國激光醫學雜志,2010(1):50-53.

[7] MINNOCK A, VERNON D I, SCHOFIELD J, et al. Mechanism of uptake of a cationic water-soluble pyridinium zinc phthalocyanine across the outer membrane ofEscherichiacoli[J]. Antimicrobial agents & chemotherapy,2000,44(3):522-527.

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[10] 欒秀玲,秦艷利,白雪峰,等.甲苯胺藍為光敏劑的光動力療法對齦上菌斑滅菌效果的研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2012,28(3):233-236.

(責任編輯：劉 巖)

The efficiency ofEscherichiacoliphotodynamic disinfection effected by light intensity and illumination time

YAN Jinhua, YANG Chen, LI Zelin, SHI Junyu, XU Zhousu

(College of Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310023, China)

In order to obtain the optimal efficiency of photodynamic disinfection, a series of comparative experiments were carried out by changing two parameters including light intensity and illumination time. In the experiments, toluidine blue with concentration of 0.1 mg/mL acts as the photosensitizer, the optical source for sterilization is Laser diode with 650 nm central wavelength and 200 mW power and Escherichia coli is used as test strains. A plate counting method is adopted to evaluate the Disinfection efficiency. Experiments show that photodynamic disinfection efficiency is effected by two optical parameter, i.e. light intensity and illumination time. With the strengthening of optical light intensity and prolonging of illumination time, the disinfection efficiency is firstly increasing and then slightly decreasing. It is concluded that the optimal disinfection efficiency could be obtained by adopting appropriate light intensity and time.

photodynamic disinfection; toluidine blue;Escherichiacoli

2016-03-30

浙江省公益技術研究項目(2015C31094)

嚴金華(1979—)，男，江蘇南通人，副教授，研究方向為光電子器件與光學傳感，E-mail：jinhua@zjut.edu.cn.

O439

A

1006-4303(2017)01-0060-04