鯉魚肝原代細胞的分離與培養方法

蔣麗輝，李意捷，傅志偉，崔 倩，楊 明

(上海大學環境與化學工程學院，上海 200444)

鯉魚肝原代細胞的分離與培養方法

蔣麗輝，李意捷，傅志偉，崔 倩，楊 明*

(上海大學環境與化學工程學院，上海 200444)

本研究在酶消化法的基礎上，通過比較不同的肝組織分離和培養條件，獲得鯉魚肝原代細胞培養的最佳培養方法和條件。首先，結合細胞數量和臺盼藍染色所得的細胞存活率，比較了胰蛋白酶消化鯉魚肝組織的不同反應溫度和時間，結果表明：肝組織用0.25%(m/V)胰蛋白酶在25℃消化40 min時細胞分離效果最好。其次，經酶消化得到的肝原代細胞粗制液，設置4種不同的細胞純化和培養條件：1)將細胞直接重懸于含10%胚牛血清(FBS)的L-15/DMEM培養基中培養；2)以10%鯉魚血清取代培養基中的胚牛血清重懸細胞并培養；3)將細胞經Percoll液密度梯度離心純化后，重懸于含10%胚牛血清的L-15/DMEM培養基中培養；4)細胞經Percoll純化后，重懸于含10%鯉魚血清的L-15/DMEM培養基中培養。利用光學顯微鏡觀察肝細胞的形態，進而通過HE染色法檢測，結果表明經Percoll純化后，肝細胞純度顯著提高；采用MTS/PMS法檢測肝細胞的增殖情況，結果表明鯉魚血清代替胚牛血清培養細胞，肝細胞活力顯著提高。本研究將為建立穩定的毒理學肝原代細胞實驗模型奠定基礎。

鯉魚；肝原代細胞；Percoll密度梯度離心；魚血清

肝臟在動物機體物質和能量代謝過程中起重要的作用，通過肝臟的代謝，許多外源化學物質轉化為無毒、低毒或者毒性更大的代謝產物[1]，因此肝臟是目前毒理學和藥理學研究的主要對象之一[2]。肝細胞適于研究外界毒物的毒性、毒理及細胞對毒物的應答和解毒機理[3]，且有研究表明體外與體內的肝毒性實驗結果有很好的正相關關系[4]，故體外培養肝細胞可作為肝組織的替代模型應用于藥理及環境毒理學等研究[5]。目前，魚類已經建立了150多種細胞系[6]，這些細胞系可標準化，管理更方便，在毒理藥理試驗中減少大量的勞動力[7]。但是細胞系分化程度低，失去了原有的遺傳和生化特性，而原代細胞可以保持大部分組織的生理生化特性[8]。此外，與細胞系相比，原代細胞更敏感，具有更高的代謝能力[9]。因此，肝原代細胞可作為更優的細胞模型應用于藥理以及環境毒理學領域。

動物肝原代細胞的培養在大小鼠、豚鼠、綿羊等陸生動物[10-14]中較多。肝細胞的分離始于20世紀60年代，Fry等[15]用機械和酶法相結合的技術首先從大鼠肝臟中分離得到肝細胞，Seglen[16]對其進一步完善發展得到了沿用至今的兩步膠原酶灌注技術法。相較于哺乳動物細胞，魚類細胞具有可在室溫下培養、可直接暴露在不同滲透壓的環境樣品中等優點[17]。魚類肝細胞的分離自Birnbaum等[18]運用膠原酶灌注法分離肝細胞開始得到逐漸發展，但是灌注法操作步驟復雜，耗費大量的膠原酶，并需要恒流灌注裝置[19]。目前有很多研究用胰蛋白酶法成功地分離了大鼠[20]、斜帶石斑魚[21]、草魚肝細胞[22]。因此，本實驗以紅鯉魚(Cyprinuscarpio)為研究對象，在酶消化法的基礎上對肝細胞培養條件進行探索，尋找其最佳培養方法和條件，以期為建立穩定的毒理學和藥理學等實驗模型奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗用紅鯉魚購買于上?；B市場，體重500～600 g，體格健壯，體表無創傷。實驗前在水箱中去氯水(25℃)養殖兩周，24 h充氣時不間斷充氣。光照周期(h)為光照∶黑暗=14∶10，每天喂食。

1.1.2 實驗試劑及儀器

無酚紅L-15培養基(L-15)、DMEM培養基、無酚紅無Ca2+Mg2+HBSS(1×)、無酚紅無Ca2+Mg2+HBSS(10×)、新生胚牛血清(FBS)均購自Thermo Fisher公司(美國)；鏈霉素/青霉素(streptomycin/penicillin，Invitrogen，美國)；0.25%胰蛋白酶[生工生物工程(上海)有限公司]；Hepes(Solarbio，中國)；魚用麻醉劑MS-222(Sigma，美國)；0.5%臺盼藍染液(Sigma，美國)；MTS(promega，美國)；PMS(Sigma，美國)；鯉魚血清自制。

培養基配方：L-15(68%)，DMEM(20%)，HEPES(1%)，雙抗(青霉素/鏈霉素，1%)，血清(10%)。

3111型CO2培養箱(Heraeus，德國)；F50型光吸收酶標儀(TECAN，瑞士)；CK-40F200倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(普析通用儀器有限公司，北京)；光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)；血球計數板(中國上海)；96孔細胞培養板(Corning，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯉魚血清的制備

用麻醉劑MS-222將紅鯉魚麻醉5 min后用無菌注射器從尾靜脈抽血，并轉移至不含抗凝劑的試管內，室溫下自然凝集30～40 min，密封試管，于4℃下3 000 rpm離心10 min，吸取上層血清于無菌離心管中，于-20℃保存備用。

1.2.2 胰蛋白酶消化法

紅鯉魚經麻醉后，用75%醫用酒精消毒魚體，采血后于無菌條件下剪開腹部取出肝組織，用無菌的冷HBSS(1×)清洗3次，除去血細胞和其他組織，用無菌剪刀剪至1～3 mm大小組織塊，再用HBSS(1×)清洗1次；加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶分別在25℃和37℃進行消化，消化時間分別為30 min和40 min，消化期間不斷轉動組織，并加入與胰蛋白酶同體積的培養基停止消化。組織消化液經100 μm篩網過濾，得到細胞懸液。將細胞懸液2次離心重懸后棄上清液，向管中加入細胞培養基，輕柔吹打，得到較純凈的細胞懸液。取在25℃、消化40 min得到的細胞懸液分為4組，第一組細胞重懸于含10%胚牛血清(FBS)的培養基中(實驗組1)，第二組細胞重懸于含鯉魚血清的培養基中(實驗組2)，剩余兩組待用。

1.2.3 Percoll工作液的配制

Percoll分離液的配制：90 mL Percoll原液與10 mL HBSS(10×)混合，制成滲透壓為335 mOsm(1 kPa=38 178 mOsm)的緩沖型Percoll工作液；取35 mL Percoll工作液與15 mL HBSS(1×)混合，在1 000 rpm，離心3 min[23]即可獲得濃度為70%的Percoll梯度分離液，其密度為1.06～1.07 g/mL。

1.2.4 鯉魚肝細胞的純化

將剩余兩組細胞懸液分別緩慢地加入70%的Percoll分離液上方，Percoll分離液和細胞懸液的體積比為7∶3，于1 000 rpm、4℃下離心10 min。離心后管內從上到下分4層：1)培養基；2)死細胞、碎片和雜細胞；3)分離液；4)肝實質。取第四層細胞沉淀，其中一組用含胚牛血清(FBS)的培養基1 000 rpm、5 min離心洗滌1次細胞，棄上清液，向管中加入含胚牛血清的細胞培養液，輕柔吹打，得到細胞懸液(實驗組3)。另一組用含鯉魚血清培養基1 000 rpm、5 min離心洗滌1次細胞，棄上清液，向管中加入含鯉魚血清的細胞培養液，輕柔吹打，得到細胞懸液(實驗組4)。

1.2.5 肝細胞的培養

將上述4組細胞懸液(實驗組1、2、3和4)稀釋至1×106cell/mL的密度，接種于96孔培養板中，置于27℃無菌培養箱中培養。

1.3 肝細胞數量、純度、存活率和活力的測定

1.3.1 細胞數量和純度測定

將細胞懸液稀釋10倍，滴于血球計數板上，并在光學顯微鏡下計數，結果以每g肝重分離的細胞個數表示。用爬片法分別將4個實驗組的細胞均勻地涂在載玻片上，用4%多聚甲醛固定20 min，室溫下晾干，蘇木素染液染色15 min，超純水洗滌，伊紅染色30 s，超純水洗滌，自然晾干后中性樹膠封片。在倒置顯微鏡下分別對肝細胞與肝非實質細胞進行計數，計算肝細胞的純度。用肝實質細胞占細胞總數的百分比表示細胞的純度。

1.3.2 細胞存活率和活力測定

細胞懸液與0.4%臺盼藍染液按1∶10體積比混合，1 min后在血球計數板上計數，活細胞圓形透明，死細胞被染成藍色。用活細胞占計數細胞中的百分比表示細胞存活率。

采用MTS/PMS[24]法檢測實驗組中肝細胞的增殖能力。提取紅鯉魚肝細胞后，以1×106cell /mL的濃度接種于96孔細胞培養板中，每孔200 μL，在分別培養24、48、72和96 h后測定各組光吸收值。測定方法為：每孔吸出50 μL培養基，加入50 μL MTS/PMS試劑，27℃，孵育2 h。在酶標儀490 nm波長下檢測各孔光吸收值，每組各8個重復孔。

1.3.3 數據處理

用SPSS軟件進行數據處理，所有數據用mean±SD表示。用獨立樣本t檢驗法分析組別間的差異顯著性。當P<0.05時表明具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 胰蛋白酶消化法對鯉魚肝細胞數量和存活率的影響

如表1所示，紅鯉魚肝組織在37℃時，經胰蛋白酶消化40 min獲得的細胞數量最多，37℃消化30 min所得細胞數量次之，第三為25℃消化40 min，而在25℃消化30 min所得的細胞最少。此外，經臺盼藍染色后所得到的細胞存活率結果發現：在25℃下胰蛋白酶消化獲得的肝細胞存活率均高于37℃胰蛋白酶消化收集的細胞。25℃時，細胞活率均大于90%，而37℃時消化收集的肝細胞存活率小于90%；其中在37℃消化40 min后，細胞存活率僅為74.6%。綜合肝細胞數量和存活率的結果表明：肝組織用0.25%胰蛋白酶在25℃消化40 min時分離效果最好。

表1 不同胰蛋白酶消化條件對鯉魚肝細胞數量和存活率影響Tab.1 The effects of different treatment conditions for trypsin digestion on the cell number and viability ofCyprinus carpio hepatocytes

2.2 Percoll分離純化對鯉魚肝細胞純度的影響

在倒置顯微鏡下觀察，新鮮分離的肝細胞呈圓形透亮且具有立體感。未經Percoll分離的實驗組1的肝細胞中可見一定數量的非實質細胞，如血細胞、細胞碎片以及死細胞(圖1A)，而實驗組3(經Percoll分離純化)中的肝細胞(圖1B)純度較高，非實質細胞數量明顯減少。

紅鯉魚肝細胞經HE染色后可見細胞質呈橙色，細胞核呈藍色，清晰可見，也可見部分雙核肝細胞。非肝細胞不具有上述特性，由此可計算出肝實質細胞的純度。不同培養條件對肝細胞純度的影響見表2。從表2可以看出，經Percoll分離純化的實驗組3和實驗組4中的肝細胞純度分別達到95.3%和96.8%，顯著高于未分離純化的實驗組1(78.5%)和實驗組2(82.7%)?？梢?，經Percoll法分離純化的肝細胞純度明顯增加。

表2 不同分離方法對鯉魚肝細胞純度的影響Tab.2 The effects of different isolation methods on purity of Cyprinus carpio hepatocytes

2.3 不同血清對鯉魚肝細胞活力的影響

根據肝活細胞的數量占總計數細胞的數量，繪制鯉魚肝細胞活力的變化圖。從圖2可以看出，實驗組2肝細胞培養24 h后，OD值增加到(0.73±0.15)；培養72 h后OD值達最高，為(1.13±0.14)，96 h后肝細胞增殖率明顯降低。實驗組1肝細胞培養24 h后，OD值增加到(0.71±0.13)；培養72 h后OD值達最高，為(0.94±0.04)，96 h后肝細胞增殖率明顯降低。實驗組4的OD值在24 h為(0.69±0.15)，實驗組3在相同時間的OD值為(0.61±0.21)，實驗組4在72 h也達到最高值(1.26±0.24)，在圖中可明顯看出其OD值高于實驗組3。四組實驗的肝細胞活力隨培養時間的延長先增長而后下降，其原因可能是由于隨著培養時間的延長，培養基中的營養物質被快速消耗，細胞由于營養的缺失導致增殖變慢；通過比較添加胚牛血清和添加鯉魚血清兩種培養基對細胞增殖的影響，結果表明，添加鯉魚血清的培養基更有利于鯉魚肝細胞的增殖。

3 討論

Walton[25]將二步灌流法應用于魚類肝細胞的分離，并分離得到了虹鱒魚肝細胞。膠原酶灌注法獲得的細胞數量雖多于胰酶消化法，但胰酶消化法的細胞活力優于膠原酶灌注法[26]。而且，膠原酶灌注法操作步驟多、耗費大量的膠原酶、技術要求高、所花費時間長、易污染[27]。綜合考慮，本實驗采用胰蛋白酶消化法。胰蛋白酶細胞的活性與其濃度、溫度和時間有關，且胰酶溶液在37℃的作用力最強，但是肝細胞存活的最佳溫度是26℃。因此，本實驗采用0.25%的胰蛋白酶液，通過設置不同的消化時間和消化溫度，確定原代肝細胞在消化溫度為25℃、消化時間為40 min時，其數量和存活率較好。同時，由于血清和蛋白質中的Ca2+、Mg2+的存在降低了胰酶的活性，故應選用不含Ca2+、Mg2+的鹽溶液配置胰酶溶液。

Percoll是一種密度梯度離心劑，由聚乙酰胺吡咯烷酮的硅膠顆粒組成，離心后可形成一定的密度梯度，不同密度的細胞會分布于不同的密度層內，由此可將肝實質細胞與非實質細胞分離[23]。實驗研究表明，經過Percoll梯度離心后，肝細胞的純度達95%以上；而不經過Percoll液純化處理，肝細胞的純度僅有約80%。這是因為實驗用Percoll梯度液的密度為1.06～1.07 g/mL，而富含活力的肝實質細胞的密度在1.07～1.10 g/mL之間，肝臟雜質細胞、肝細胞碎片及受損肝細胞的密度均在1.04 g/mL以下[28]。故通過Percoll梯度液純化分離的肝細胞，可進一步提高肝實質細胞純度。

細胞的生長受血清、培養基和其他添加物的影響，由于培養基添加的血清中含有各種生長因子、營養物質等有助于細胞生長的物質，所以血清的濃度會影響細胞的貼壁和生長[6]。細胞培養大多使用FBS作為培養基中的營養物質，也有研究以魚血清作為營養物質。Kocal等[29]研究發現在培養基中添加自制虹鱒魚血清增加肝細胞的貼壁率，且能形成單層細胞。而胚牛血清對其肝細胞貼壁率影響不大。而在本實驗中采用鯉魚血清代替胚牛血清，研究結果表明，鯉魚血清組肝細胞活力明顯高于胚牛血清組。

4 結論

通過Percoll梯度液純化胰蛋白酶消化法分離的肝細胞，可顯著提高肝實質細胞的活力與純度；用鯉魚血清替代傳統培養基中的胚牛血清，肝細胞的生長效果明顯更好。本論文從消化方法、分離純化方法和培養方法等方面對紅鯉魚的原代肝細胞的獲得進行了初步探討，并成功得到一種較優的提取流程，從而為環境毒理學、分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等領域的深入研究提供了模型細胞。

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Isolation and culture of primary hepatocytes fromCyprinuscarpio

JIANG Lihui，LI Yijie，FU Zhiwei，CUI Qian，YANG Ming*

(School of Environmental and Chemical Engineering，Shanghai University，Shanghai 200444，China)

In the present study，the optimal conditions for isolation and culture of the primary hepatocytes from liver ofCyprinuscarpiowere explored.The condition for digestion reaction with trypsin was optimized first and the results from trypan blue staining indicated that the mortality of primary hepatocytes was the highest after treatment of fish liver tissue with trypsin at 25oC for 40 min.Four different purification and culture conditions were then set up with crude liver cell suspension after trypsin digestion：1.Cells were directly incubatedin L-15/DMEM medium containing 10% fetal bovine serum(FBS)；2.Cells were incubated with L-15/DMEM medium containing 10% carp serum；3.Cells were purified using Percoll density gradient centrifugation and then cultured in L-15/DMEM medium containing 10% fetal bovine serum；4.Cells were purified with Percoll and then cultured with L-15/DMEM medium containing 10% carp serum.The results from the morphology by HE staining revealed that the purification by Percoll significantly improved the purity of hepatocytes.In addition，the replacement of bovine serum by carp serum significantly increased the cell proliferation based on the MTS/PMS results.This study will lay the foundation for the establishment of a stable primary hepatocyte model for further toxicological research.

Cyprinuscarpio；primary hepatocytes；Percoll density gradient centrifugation；fish serum

2016-10-12

國家自然科學基金(No.31470554)；上海市教委創新項目(No.14YZ001).

蔣麗輝(1994-)，女，碩士研究生，研究方向為抗抑郁藥在水體環境的毒性.E-mail：759786441@qq.com

楊 明(1979-)，女，副研究員，主要研究方向為水生生態毒理學.E-mail：mingyang@shu.edu.cn

S961.6

A

1006-5601(2017)01-0001-07

蔣麗輝，李意捷，傅志偉，等.鯉魚肝原代細胞的分離與培養方法[J].漁業研究，2017，39(1)：1-7.