腦缺血預(yù)處理對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后細(xì)胞凋亡的影響

羅仁國 段 劫 趙 龍 熊 平 段軍偉

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川南充 637000）

腦缺血預(yù)處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）即一次或多次短暫的非致死性腦缺血可誘導(dǎo)缺血腦組織對今后一定時(shí)間段的腦缺血損傷產(chǎn)生耐受性。一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)短暫缺血預(yù)處理可以激發(fā)或動員機(jī)體的潛在防護(hù)能力，對隨后的嚴(yán)重缺血缺氧產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)作用[1]。動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，SAH）具有高致死性及高致殘性，有12.4%的患者在就診前即已死亡，多達(dá)40%～60%的患者在首次出血的48 h內(nèi)死亡，而腦組織缺血缺氧在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要作用。本研究擬通過對實(shí)驗(yàn)性SAH大鼠進(jìn)行缺血預(yù)處理，觀察SAH大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及神經(jīng)行為學(xué)的變化情況，探討缺血預(yù)處理在SAH中的作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

本研究采用Sprague-Dawley成年雄性大鼠（300 g,川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心）。所有大鼠于24℃下12 h明暗周期下飼養(yǎng)，操作程序均按動物使用和管理委員會的當(dāng)?shù)刂改线M(jìn)行，并按照中國國家動物福利法給予處死。共78只大鼠隨機(jī)分為6組：A組（n=6，正常對照組）；B組（n=18，假手術(shù)組）；C組（n=18，缺血預(yù)處理組）；D組（SAH組）；E組（n=18，缺血預(yù)處理1天后SAH組）。除A組外，其余各組再根據(jù)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間不同分為1、3、7 d三個(gè)亞組，每亞組6只。

1.2 缺血預(yù)處理操作方式

參照經(jīng)典四血管阻斷法加以改良后建立大鼠全腦缺血預(yù)處理模型。實(shí)驗(yàn)動物在術(shù)前一天禁食，術(shù)前6 h禁飲。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉。大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，于頸部鎖骨上正中線切開皮膚約15 mm，鈍性分離皮下組織，游離暴露雙側(cè)頸總動脈和鎖骨下動脈起始部，用無損傷動脈夾夾閉180 s。預(yù)處理后用稀釋慶大霉素鹽水沖洗創(chuàng)面并逐層縫合。動脈夾閉期間，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠對疼痛刺激的反應(yīng)、瞳孔對光反射及翻正反射，以判斷腦缺血模型是否成功。入選大鼠應(yīng)保證瞳孔對光反射消失，對疼痛刺激無反應(yīng)，翻正反射消失。假手術(shù)組只分離動脈而不夾閉。

1.3 缺血預(yù)處理后蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的建立

缺血預(yù)處理3 min后3 d行蛛網(wǎng)膜下腔出血模型法造模。采用視交叉池注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。麻醉Sprague-Dawley雄性大鼠。給大鼠插管，維持呼吸道通暢。用電熱墊維持大鼠體溫為（37±0.5）℃。采用腦立體定向方法導(dǎo)入定點(diǎn)于中線前囪前6.5 mm處，與垂直面呈30°角。使穿刺針頭的孔口向右，針頭落下使針尖直達(dá)至顱底、視交叉前2～3 mm處。在股動脈穿刺取血，抽取250 μL血液，3 min內(nèi)勻速注射入視交叉前池。此后，保持大鼠麻醉狀態(tài)約1 h，使之從顱內(nèi)刺激中逐漸恢復(fù)。于每只大鼠解剖取腦時(shí)再次證實(shí)SAH。在觀察期間內(nèi)，定時(shí)監(jiān)測大鼠生命體征。

1.4 實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)改變觀察及評分

分別于預(yù)定時(shí)間對各組大鼠按照Longa評分[2]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。活動正常且無神經(jīng)功能缺損者記0分；出現(xiàn)豎毛或輕度運(yùn)動低下者記0.5分；不能完全伸直前肢或后肢者記1分；肢體癱瘓或行動不協(xié)調(diào)、追尾者記2分；不能站立或行動時(shí)向一側(cè)傾倒者記3分；無自發(fā)性運(yùn)動或有明顯意識障礙者記4分。

1.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測

大鼠造模術(shù)后按相應(yīng)時(shí)間段快速斷頭處死，完整取出腦組織，并保持蛛網(wǎng)膜完整性。經(jīng)10%福爾馬林固定、漂洗、脫水、透明、石蠟包埋后，在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切開鼠腦（切片包含腦干和基底動脈）。切片進(jìn)行TUNEL染色，采用雙盲法在400倍光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率（TUNEI染色細(xì)胞陽性率）。海馬CA1神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率=海馬CA1區(qū)TUNEI染色陽性細(xì)胞數(shù)量/海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量*100%。切片中正常神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色呈藍(lán)色，胞核相對較大，形態(tài)大小較一致。凋亡神經(jīng)元細(xì)胞TUNEL染色呈棕色，形態(tài)呈濃縮或點(diǎn)片狀，不規(guī)則，大小不一致。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行資料分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，采用SNK法進(jìn)行兩兩比較；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察及神經(jīng)行為評分

D組及E組實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)不同程度的行為異常，可表現(xiàn)為納差、反應(yīng)遲鈍、自潔能力差、毛發(fā)雜亂、自主運(yùn)動減少、頸項(xiàng)強(qiáng)直，部分大鼠出現(xiàn)意識障礙、肢體癱瘓、抽搐甚至角弓反張。大鼠神經(jīng)行為學(xué)異常以SAH后的1、3 d最為明顯，后逐漸緩解。D組神經(jīng)行為學(xué)評分最高，與其他各組相比，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；E組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評分均較D組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組間實(shí)驗(yàn)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的檢測

A，B，C組海馬神經(jīng)元細(xì)胞未見或僅有極少量TUNEL染色陽性凋亡細(xì)胞；D，E，F(xiàn)組海馬神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，其中以SAH后第3天時(shí)最為突出。各亞組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率見表2。A，B，C各亞組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各時(shí)間點(diǎn)E組神經(jīng)元凋亡率均低于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

3 討論與結(jié)論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是多種病因引起的腦底部或腦、脊髓表面血管破裂導(dǎo)致急性出血性腦血管疾病，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔，又稱原發(fā)性或自發(fā)性SAH。約90%的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起，由于出血迅速，可短期內(nèi)引起顱內(nèi)壓急劇升高，導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損害，多達(dá)40%～60%的患者在首次出血的48 h內(nèi)死亡[3]。其腦損傷機(jī)制既包括早期腦損害，又包括遲發(fā)性缺血性損害，在腦保護(hù)藥物、手術(shù)技巧、手術(shù)策略等研究相同的條件下，疾病的預(yù)后主要由腦組織缺血缺氧能否得到有效干預(yù)有關(guān)。

表1 各亞組實(shí)驗(yàn)大鼠相應(yīng)時(shí)間段的神經(jīng)行為學(xué)評分值表（x±s）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率（x±s）

缺血預(yù)處理由Murry[4]在心肌缺血實(shí)驗(yàn)研究中首先發(fā)現(xiàn)。報(bào)道指出，通過亞致死性的短暫缺血處理，誘導(dǎo)缺血組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，可以使機(jī)體在一定程度上減輕再次發(fā)生的缺血性損傷。隨后Kitagawa[5]等用沙土鼠全腦缺血模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過腦缺血預(yù)處理也可誘發(fā)腦組織產(chǎn)生缺血耐受現(xiàn)象。目前，腦缺血預(yù)處理的研究多采用的是單次或重復(fù)短暫缺血來觀察隨后致死性缺血所引起的腦損傷情況。研究表明，預(yù)處理的效應(yīng)可表現(xiàn)為早期保護(hù)效應(yīng)和延遲保護(hù)效應(yīng)，早期保護(hù)效應(yīng)發(fā)生在預(yù)處理后數(shù)小時(shí)內(nèi)，主要與腺普受體激活和鉀通道開放相關(guān)；延遲保護(hù)效應(yīng)多在預(yù)處理后2～4 d內(nèi)達(dá)到高峰[6，7]。因此，我們在本實(shí)驗(yàn)中在缺血預(yù)處理3 d后進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔出血建模。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：D組神經(jīng)行為學(xué)改變評分最高，與A，B，C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05），說明采用視交叉池注血成功建立了SAH模型，且大鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)行為學(xué)改變，這種變化在造模后3 d最為明顯，7 d時(shí)有所恢復(fù)；與D組相比，E組大鼠雖然也出現(xiàn)了神經(jīng)功能變化，但其程度在1、3、7 d亞組均較D組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明缺血預(yù)處理可以減輕實(shí)驗(yàn)大鼠SAH后神經(jīng)功能障礙，對SAH后腦損害有保護(hù)作用。對于其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，我們觀察并比較了海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果顯示，3 min缺血預(yù)處理即可造成海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；D組SAH后大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元細(xì)胞密度較低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增加，而E組大鼠海馬CA1區(qū)雖然也可觀察到明顯的掉網(wǎng)現(xiàn)象，但是凋亡率較D組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦缺血預(yù)處理可以顯著降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。

綜上，我們通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了缺血預(yù)處理對SAH大鼠缺血腦組織有明顯的保護(hù)作用，可以明顯改善神經(jīng)功能障礙程度，其機(jī)制與增加腦組織對缺氧的耐受性，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[1] 王國峰，劉伯芹，趙玉芳，等. 缺血預(yù)處理對腦缺血大鼠血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)及微血管密度變化的影響[J]. 中國卒中雜志，2011，6（11）：869-875.

[2] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20：84-91.

[3] 楊彬彬，唐曉平，趙龍，等.高壓氧對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2016，10（7）：974-977.

[4] Murry CE，Jenings RS，et al.Preconditioning with ischemia dalay of lethal cell injury in myocardium[J].Circulation，1986，74（5）：1124-1127.

[5] Kitagawa K，Matsumoto M，Masafumi Tagaya，et al."Ischemic tolerance" phenomenon found in the brain[J].Brain research，1990，528：21-24.

[6] Valentim LM，Geyer AB，Tavares A，et al.Effects of global cerebral ischemia and preconditioning on heat shock protein 27 immuno content and phosphorylation in rat hippocampus[J].Neuronscience，2001，107：43-44.

[7] 李建民，趙雅寧，安超旺，等.腦缺血預(yù)處理對沙鼠前腦缺血再灌注后HSP70表達(dá)水平及學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（1）：55-59.