水稻LOC_Os10g05490位點(diǎn)冷脅迫條件下表達(dá)分析及CRISPR/Cas9定向編輯

沈春修

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

水稻LOC_Os10g05490位點(diǎn)冷脅迫條件下表達(dá)分析及CRISPR/Cas9定向編輯

沈春修

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

為探明LOC_Os10g05490位點(diǎn)冷脅迫條件下的表達(dá)特性和耐冷性功能，以耐冷東鄉(xiāng)野生稻和冷敏感水稻93-11為試驗(yàn)材料進(jìn)行了半定量分析，結(jié)果表明，LOC_Os10g05490在冷敏感水稻93-11冷處理前后表達(dá)豐度相當(dāng)，而在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中冷處理后表達(dá)豐度下調(diào)，這一結(jié)果與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)結(jié)果相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了該位點(diǎn)可能與水稻耐冷相關(guān)，隨后利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)LOC_Os10g05490編碼區(qū)于同樣具有較強(qiáng)耐冷性的粳稻品種臺(tái)北309中實(shí)施定向基因敲除，并成功獲得了26株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

冷脅迫；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；東鄉(xiāng)野生稻；CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)

水稻是喜溫作物，低溫冷害是影響水稻發(fā)育和生產(chǎn)的一種主要環(huán)境脅迫因子，尤其對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)的影響和破壞最為嚴(yán)重，挖掘水稻資源苗期耐冷基因、提高栽培水稻耐冷性對(duì)于穩(wěn)定水稻產(chǎn)量具有重要意義。

從目前國(guó)內(nèi)外的研究來看，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為水稻苗期的耐冷性表現(xiàn)是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜性狀。近十年來，水稻苗期耐冷QTLs定位研究發(fā)展迅速，已有許多關(guān)于水稻苗期耐冷相關(guān)QTLs成功定位的報(bào)道。錢前等[1]利用秈粳雜交獲得的DH群體作為試驗(yàn)材料分別在水稻的第 1、2、3 和 4 染色體上檢測(cè)到了與水稻苗期耐冷相關(guān)的 4個(gè)QTLs。陳大洲等[2]使用協(xié)青早B/東鄉(xiāng)野生稻的 BC1F1群體，在水稻的第4和第8染色體上發(fā)現(xiàn)了與東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷性連鎖遺傳的SSR 標(biāo)記 RM28和RM337。詹慶才等[3]利用二九青和Yukihlkari雜交，然后再經(jīng)過多代自交之后的重組自交系(RIL)群體為材料，共定位了11個(gè)水稻苗期耐冷QTLs，它們分別位于水稻染色體 1(2個(gè))、2(2個(gè))、3、5、6、7、8、9和12上。劉之熙等[4]利用秈粳交RIL群體，以冷處理后的秧苗葉綠素含量、丙二醛含量及植株凋萎率為耐冷性指標(biāo)，在水稻的第9染色體RM105-RM257區(qū)間內(nèi)定位到了一個(gè)主效QTL。鄭加興等[5]利用DP15和DP30為耐冷供體、9311為受體構(gòu)建染色體片段代換系BC4F2，以成苗率作為耐冷指標(biāo)，在水稻12條染色體上總共檢測(cè)到19個(gè)與水稻苗期耐冷相關(guān)的QTL。夏瑞祥等[6]利用耐冷東鄉(xiāng)野生稻和南京11構(gòu)建的BC2F1分離群體為研究材料，以根電導(dǎo)率作為耐冷性評(píng)價(jià)指標(biāo)，在水稻的第10染色體上SSR標(biāo)記RM304-RM1108區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到了2個(gè)主效QTLqRC10-1和qRC10-2，它們對(duì)耐冷表型貢獻(xiàn)率分別為34.13%和37.02%。目前，利用這種連鎖分析的方法在水稻的12條染色體上均已檢測(cè)到與苗期耐冷性相關(guān)的QTL，但連鎖分析方法是利用系譜和標(biāo)記信息，將QTL定位在染色體上的一定區(qū)間范圍內(nèi)，由于缺乏足夠多的遺傳重組事件，基因定位過程中的置信區(qū)間一般較大，無(wú)法鑒別目標(biāo)性狀的表達(dá)是單個(gè)基因還是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，這也是目前水稻苗期耐冷相關(guān)QTL精細(xì)定位和克隆較少的原因之一。因此，繼續(xù)從耐冷性強(qiáng)的水稻材料中克隆耐冷相關(guān)基因很有必要。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，尤其是RNA-seq(RNA sequence)技術(shù)的不斷完善和測(cè)序成本的大幅下降，以及一些新的分子生物學(xué)技術(shù)諸如CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated proteins)基因敲除技術(shù)在基因功能研究中日益廣泛的應(yīng)用，除定位克隆與同源基因克隆之外，應(yīng)重視脅迫條件下水稻耐冷相關(guān)基因的差異表達(dá)分析與敲除基因后的水稻突變體分析。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)是繼 ZFN(zinc finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)之后建立的又一新型靶向基因敲除技術(shù)，該技術(shù)通過設(shè)計(jì)1個(gè)sgRNA-Cas9體系作用于研究對(duì)象，導(dǎo)致目標(biāo)靶位點(diǎn)的DNA雙鏈發(fā)生斷裂(DSB)，而后依賴生物體自身的同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接 (non-homologous end joining，NHEJ)對(duì)受損位點(diǎn)的修復(fù)作用而最終實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的改造[7-8]。在生物的同源重組修復(fù)過程中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有同源臂的靶DNA序列存在時(shí)，攜帶有同源臂的外源基因就能夠整合到靶標(biāo)位點(diǎn)的DNA序列上。如將人工合成的供體 DNA 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，那么生物體將以該DNA為模板，可以有效地提高定點(diǎn)修飾基因的效率。相對(duì)同源重組修復(fù)而言，非同源末端連接修復(fù)機(jī)制的保真性較弱，非同源末端連接修復(fù)往往會(huì)導(dǎo)致DNA斷裂處堿基發(fā)生突變，通常情況下會(huì)造成堿基的缺失，這種錯(cuò)誤的修復(fù)方式如果發(fā)生在目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域，就會(huì)引起該基因編碼閱讀框發(fā)生改變，使基因發(fā)生定點(diǎn)突變而導(dǎo)致基因功能的喪失[9-10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個(gè)由核酸和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物，該系統(tǒng)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)的識(shí)別是依賴于堿基的互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行的，靶向敲除一個(gè)位點(diǎn)只需要在原有載體的基礎(chǔ)上替換20～30 bp的核苷酸，相當(dāng)于合成一對(duì)引物，所以，相對(duì)于ZFN和TALEN技術(shù)而言，CRISPR-Cas9靶向敲除技術(shù)的構(gòu)建過程更加簡(jiǎn)單，周期更短且效率更高，適合于規(guī)模化、高通量的組裝。目前，CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于人體細(xì)胞[11-12]、小鼠[13-15]、斑馬魚[16-17]、酵母[18]、果蠅[19-20]、線蟲[21]、煙草[22]、擬南芥[23]及水稻[24]等作物的相關(guān)目的基因的功能研究中，并取得了一定的成效。

基于前期耐冷東鄉(xiāng)野生稻與冷敏感水稻93-11冷脅迫條件下(4 ℃處理3 d)的RNA-seq數(shù)據(jù)分析[25]，檢測(cè)到LOC_Os10g05490位點(diǎn)冷處理后在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中的表達(dá)量顯著下調(diào)，而在冷敏感水稻93-11中冷處理前后無(wú)表達(dá)差異，推測(cè)該基因可能與水稻的耐冷性相關(guān)，本研究首先通過半定量分析驗(yàn)證了該基因在冷脅迫條件下的(4 ℃處理3 d)表達(dá)情況，證實(shí)與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果一致后，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)LOC_Os10g05490編碼區(qū)于同樣具有較強(qiáng)耐冷性的粳稻品種臺(tái)北309中實(shí)施定向基因敲除，旨在獲得該位點(diǎn)的敲除突變體植株，從而為該位點(diǎn)的耐冷性功能鑒定研究奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

耐冷水稻東鄉(xiāng)野生稻、冷敏感秈稻93-11以及轉(zhuǎn)基因受體材料的粳稻品種臺(tái)北309，均由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 載體與菌株

CRISPR/Cas9克隆載體psgR-Cas9-Os是以pMD18 載體為骨架改造得到的(圖1)，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院惠贈(zèng)，植物雙元表達(dá)載體pSK51(圖2)、農(nóng)桿菌菌株EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α購(gòu)自全式金生物公司。

圖1 Cas9克隆載體psgR-Cas9-Os示意圖Fig.1 The map of Cas9 clone vector psgR-Cas9-Os

圖2 植物雙元表達(dá)載體pSK51示意圖Fig.2 The map of plant binary expression vector pSK51

1.1.3 主要試劑

RNA 抽提試劑盒RNAiso Plus 及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自寶生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BbsI、EcoR I和HindⅢ購(gòu)自Fermentas公司；GXLTaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；T4DNA連接酶和質(zhì)粒小量抽提試劑盒Easypure?Hipure Plasmid Miniprep Kit均購(gòu)自全式金生物公司；其他植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 半定量RT-PCR

將水稻幼苗于正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)至三葉期，然后轉(zhuǎn)移至4 ℃培養(yǎng)箱低溫脅迫處理3 d 后取葉片組織于液氮中研磨成粉，按試劑盒說明提取總RNA，測(cè)定260、280 nm處的吸光值，計(jì)算D260/D280比值，確定總RNA的純度。通過D260的值分別對(duì)處理前后的材料的總RNA進(jìn)行定量。取等量處理前后不同材料的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成第一鏈cDNA。根據(jù)水稻Actin基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物：Actin-F: GACATTCAGCGTTCCAGCCATGTAT；Actin-R: TGGAGCTTCCATGCCGATGAGAGA；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min 預(yù)變性；95 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。參考公共數(shù)據(jù)庫(kù)中日本晴品種對(duì)應(yīng)位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)LOC_Os10g05490特異擴(kuò)增引物：05490-F: TTCCAGCTTCTCTCAGACGC； 05490-R: GAACAGTAGGCTCGCCATG。 擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min 預(yù)變性；95 ℃ 30 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 目標(biāo)基因靶位點(diǎn)選擇、靶點(diǎn)接頭分子設(shè)計(jì)和復(fù)性

在目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域找到任意NGG(PAM)的位置， 選擇其上游的20個(gè)堿基為靶位點(diǎn)序列(不含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，根據(jù)靶位點(diǎn)序列合成2條攜帶接頭的寡聚靶點(diǎn)接頭分子Oligo1和Oligo2(Oligo1:5’-TGGCACGGCGCCAGCATCACCGAC-3’； Oligo2:5’-AAACGTCGGTGATGCTGGCGCCGT-3’)，接頭序列與經(jīng)BbsI酶切后的載體粘性末端互補(bǔ)。將合成好的2條寡聚靶點(diǎn)接頭分子用TE溶解成100 μmol·L-1母液，各取1 μL加入到98 μL 0.5×TE混合稀釋到1 μmol·L-1。約90 ℃ 30 s，移至室溫冷卻完成退火復(fù)性(圖3)。

圖3 靶點(diǎn)接頭退火復(fù)性示意圖
Fig.3 Annealing of target site connector primer

1.2.3 靶點(diǎn)接頭的克隆

將經(jīng)退火復(fù)性制備好的雙鏈靶點(diǎn)接頭與經(jīng)BbsⅠ酶切后回收的Cas9克隆載體psgR-Cas9-Os按靶點(diǎn)接頭與載體摩爾比約 3∶1～5 ∶1的比例進(jìn)行連接，連接程序?yàn)?2 ℃ 3 h，16 ℃過夜連接[26]。而后將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Trans5α，選擇PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定片段大小正確的陽(yáng)性克隆菌株送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆即為靶點(diǎn)接頭的重組Cas9敲除克隆載體菌株。

1.2.4 測(cè)序及序列分析

所有克隆樣品的測(cè)序均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成，測(cè)序數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過Align Sequences Nucleotide BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.5 Cas9敲除植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻受體品種

使用電穿孔法將Cas9敲除植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，再借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[27-29]轉(zhuǎn)化水稻受體品種臺(tái)北309，組織培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基參照李丁[30]使用的配方進(jìn)行配制。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽(yáng)性檢測(cè)

使用CTAB法分別提取T0代轉(zhuǎn)基因水稻總DNA，參考位于表達(dá)載體上的潮霉素抗性標(biāo)記基因

序列設(shè)計(jì)特異引物(Hpt-F：5′-GCTTCTGCGGGCGATTTGTG-3′；Hpt-R：5′-CTGAACTCACCGCGACGTCTG-3′)對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫條件下LOC_Os10g05490基因的表達(dá)

通過對(duì)前期耐冷東鄉(xiāng)野生稻與冷敏感水稻93-11在冷脅迫條件下(4 ℃處理3 d)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析[25]，檢測(cè)到冷處理后在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os10g05490位點(diǎn)的表達(dá)量顯著下調(diào)，處理后該基因的表達(dá)量還不到處理前的1/32，而在冷敏感水稻93-11中冷處理前后該基因表達(dá)量無(wú)差異(|log2Ratio|≥1符合差異表達(dá))(表1)，為了驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究分別提取正常生長(zhǎng)條件和冷脅迫條件下(4 ℃處理3 d)93-11和東鄉(xiāng)野生稻幼苗葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以水稻肌動(dòng)蛋白基因Actin的表達(dá)作為內(nèi)標(biāo)，利用半定量RT-PCR方法對(duì)LOC_Os10g05490在冷處理前后的表達(dá)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，半定量分析與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致(圖4)，LOC_Os10g05490在冷敏感水稻93-11冷處理前后表達(dá)豐度相當(dāng)，而在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中冷處理后表達(dá)豐度下調(diào)。

2.2LOC_Os10g05490靶標(biāo)位點(diǎn)的Cas9克隆載體構(gòu)建

在LOC_Os10g05490的第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)接頭引物，將制備好的LOC_Os10g05490的雙鏈靶點(diǎn)接頭分別與經(jīng)BbsⅠ酶切后回收的Cas9克隆載體psgR-Cas9-Os進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，在含100 mg·L-1的氨芐青霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取單菌落搖菌后抽提質(zhì)粒，由于靶點(diǎn)接頭太短不適合使用酶切鑒定，本研究使用M13-F(位于載體上sgRNA的上游)和靶點(diǎn)接頭引物(Oligo2)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示，所有陽(yáng)性克隆都擴(kuò)增出了253 bp的目的條帶，只有以psgR-Cas9-Os空載體為模板的陰性對(duì)照未擴(kuò)增出目的條帶，表明該基因靶標(biāo)位點(diǎn)的Cas9克隆載體Cas9-05490已經(jīng)構(gòu)建成功(圖5)，質(zhì)粒送樣測(cè)序結(jié)果也證實(shí)該基因靶標(biāo)位點(diǎn)的Cas9克隆載體構(gòu)建正確。

表1 冷處理前后LOC_Os10g05490在93-11和東鄉(xiāng)野生稻中的表達(dá)情況

Table 1 Expression ofLOC_Os10g05490 in Dongxiang wild rice and 93-11 before and after cold treatments

水稻品種Read1Read2RPKM1RPKM2log2RatioUp/Down東鄉(xiāng)野生稻80213.960.42-5.06down93-11450.670.980.54Up

Read 1、Read 2: 冷處理前、后在LOC_Os10g05490 位點(diǎn)表達(dá)譜測(cè)序檢測(cè)到的讀段數(shù)目; RPKM1、RPKM2: 冷處理前、后的表達(dá)量; Ratio: 同一基因處理組與對(duì)照組的RPKM 的比值。

Read1 and Read2 are the read number ofLOC_Os10g05490 detected in RNA-seq before and after cold treatment; RPKM1 and RPKM2 are the expression before and after cold treatment; Ratio: Ratio of RPKM of treated group compared with RPKM of control group.

9311-1: 冷處理前在93-11中的表達(dá)量; 9311-2: 冷處理后在93-11中的表達(dá)量; DX-1: 冷處理前在東鄉(xiāng)野生稻中的表達(dá)量; DX-2: 冷處理后在東鄉(xiāng)野生稻中的表達(dá)量9311-1: Expression in 93-11 before cold treatment; 9311-2: Expression in 93-11 after cold treatment; DX-1: Expression in Dongxiang wild rice before cold treatment; DX-2: Expression in Dongxiang wild rice after cold treatment圖4 冷處理前后LOC_Os10g05490的表達(dá)模式Fig.4 Expression of LOC_Os10g05490 gene before and after cold treatments

2.3LOC_Os10g05490靶標(biāo)位點(diǎn)的Cas9敲除植物表達(dá)載體構(gòu)建

按圖6所示方法進(jìn)行LOC_Os10g05490靶標(biāo)

位點(diǎn)的Cas9敲除植物表達(dá)載體的構(gòu)建，將測(cè)序正確的LOC_Os10g05490重組Cas9克隆質(zhì)粒Cas9-05490使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，回收包含Cas9和引導(dǎo)RNA的約5.6 kb載體大片段，然后與經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后回收的約11 kb植物雙元表達(dá)載體pSK51的大片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，在含50 mg·L-1的卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落搖菌后抽提質(zhì)粒，使用EcoR I和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切鑒定結(jié)果表明，該基因的Cas9敲除植物表達(dá)載體pSK51-Cas9-05490已經(jīng)構(gòu)建成功(圖7)，重組質(zhì)粒測(cè)序也證實(shí)了這一結(jié)果。

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽(yáng)性檢測(cè)

將經(jīng)過酶切鑒定以及測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pSK51-Cas9-05490，利用電激法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得pSK51-Cas9-05490的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子后侵染受體水稻品種TP309的胚性愈傷組織，經(jīng)過共培養(yǎng)后，將愈傷組織接入篩選培養(yǎng)基(含50 mg·L-1潮霉素)上，適當(dāng)延長(zhǎng)篩選培養(yǎng)時(shí)間(3～4次篩選，平均半月更換一次培養(yǎng)基)，獲得抗性愈傷組織后，經(jīng)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)過程后，LOC_Os10g05490的Cas9敲除植物表達(dá)載體共獲得34棵轉(zhuǎn)基因植株(圖8)。其中陽(yáng)性植株26株，陽(yáng)性率達(dá)76.5%，圖9顯示為部分轉(zhuǎn)基因植株潮霉素抗性標(biāo)記基因特異引物(Hpt-F和Hpt-R)PCR陽(yáng)性鑒定結(jié)果。

M: DNA ladder; 1-11: 重組轉(zhuǎn)化子; 12: 陰性對(duì)照M: DNA ladder; 1-11: Recombined clones; 12: Negative control圖5 Cas9-05490重組轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of Cas9-05490 recombined clones

圖6 植物表達(dá)載體pSK51-Cas9的構(gòu)建流程Fig.6 Construction of plant expression vector pSK51-Cas9

M: DNA ladder; 1: 重組質(zhì)粒pSK51-Cas9-05490的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鑒定M: DNA ladder; 1: Double digestion of recombinant plasmid pSK51-Cas9-05490 by EcoR Ⅰ and Hind Ⅲ圖7 重組質(zhì)粒pSK51-Cas9-05490的酶切鑒定Fig.7 Digestion identification of pSK51-Cas9-05490

3 討論

在本試驗(yàn)中，結(jié)合耐冷東鄉(xiāng)野生稻與冷敏感水稻93-11在冷脅迫條件下(4 ℃處理3 d)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析[25]和半定量表達(dá)分析，證實(shí)了水稻LOC_Os10g05490位點(diǎn)冷處理后在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中的表達(dá)量下調(diào)，而在冷敏感水稻93-11中冷處理前后無(wú)表達(dá)差異，推測(cè)LOC_Os10g05490位點(diǎn)可能在耐冷水稻的耐冷調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，已經(jīng)有報(bào)道在東鄉(xiāng)野生稻的第10染色體上SSR標(biāo)記RM304-RM1108區(qū)間內(nèi)(Chr10∶18211874-18716363)檢測(cè)到了2個(gè)耐冷相關(guān)的QTL位點(diǎn)qRC10-1和qRC10-2[6]，而本研究通過在Rice Genome Annotation project網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu)中瀏覽查詢?cè)搮^(qū)間的所有基因位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)LOC_Os10g05490位點(diǎn)并不位于這2個(gè)QTL位點(diǎn)所在區(qū)域，表明該位點(diǎn)可能是一個(gè)新的水稻苗期耐冷相關(guān)基因位點(diǎn)。對(duì)于脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中與脅迫相關(guān)的上調(diào)差異表達(dá)基因，一般可通過構(gòu)建該基因的過表達(dá)載體和基因沉默(RNAi)來進(jìn)行功能驗(yàn)證，而本研究證實(shí)，冷脅迫條件下LOC_Os10g05490位點(diǎn)在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中表達(dá)量下調(diào)。本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)LOC_Os10g05490編碼區(qū)于同樣具有較強(qiáng)耐冷性的粳稻品種臺(tái)北309中實(shí)施定向基因敲除，后續(xù)通過分析該位點(diǎn)的敲除突變體植株在相同冷脅迫條件下的表現(xiàn)來鑒定該位點(diǎn)的耐冷性功能。

A，愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)；B，篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的抗性愈傷組織；C，抗性愈傷組織的再分化；D，轉(zhuǎn)化植株的生根壯苗A， Coculture of calli with agrobacterium; B， The resistant callus; C， Resistant calli redifferentiation; D， Rooting of transgenic seedling圖8 水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程實(shí)物圖Fig.8 The map of rice genetic transformation process

M: DNA ladder; 1: 野生型陰性對(duì)照; 2: pSK51-Cas9-05490質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照; 3～5、8、10～11、13～15: 陽(yáng)性植株; 6～7、9、12: 假陽(yáng)性M: DNA ladder; 1: Wild type negative controls; 2: pSK51-Cas9-05490 plasmid positive control; 3-5， 8， 10-11， 13-15: Positive resistant callus; 6-7， 9， 12: False positive control圖9 pSK51-Cas9-05490轉(zhuǎn)基因植株潮霉素引物PCR鑒定Fig.9 PCR identification of transgenic rice lines of pSK51-Cas9-05490 with hygromycin primer

根據(jù)Rice Genome Annotation project網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu)中查詢的序列信息和蛋白功能注釋，LOC_Os10g05490基因全長(zhǎng)2 811 bp，共2個(gè)外顯子，cDNA全長(zhǎng)1 548 bp，編碼一種細(xì)胞色素P450單加氧酶類化合物，單加氧酶(monooxygenase)廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)，主要參與生物體的內(nèi)源性化合物的合成、降解以及外源性化合物的降解與活化等作用[31]。

李慧等[32]研究發(fā)現(xiàn)，使用一定濃度的氯化鈉、聚乙二醇、甘露醇或脫落酸處理杜梨幼苗時(shí)，其中的甜菜堿合成相關(guān)的膽堿單加氧酶基因PbCMO在杜梨幼苗的根和葉中的表達(dá)量明顯上調(diào)，表明PbCMO對(duì)鹽堿、干旱、滲透脅迫和ABA均存在脅迫表達(dá)響應(yīng)，該基因可能在杜梨應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)參與相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。尹錄錄[33]通過對(duì)青蒿試管苗進(jìn)行低溫處理，并采用半定量RT-PCR測(cè)定了細(xì)胞色素P450單加氧酶基因CYP71AV1的表達(dá)水平，結(jié)果表明，CYP71AV1基因的表達(dá)受到冷脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CYP71AV1基因在冷脅迫條件下的誘導(dǎo)表達(dá)受到Ca2+通道抑制劑和Ca2+螯合劑的阻遏，由此推測(cè)CYP71AV1基因的低溫誘導(dǎo)表達(dá)可能受到Ca2+-鈣調(diào)蛋白(CaM)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。潘麗娟等[34]通過半定量分析發(fā)現(xiàn)，水稻幼苗組織中膽堿單加氧酶基因OsCMO的表達(dá)受到高鹽、低溫以及干旱等脅迫的上調(diào)誘導(dǎo)，表明該基因可能在水稻抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫條件下水稻LOC_Os10g05490位點(diǎn)在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中的表達(dá)量顯著下調(diào)，而在冷敏感水稻93-11中冷處理前后無(wú)表達(dá)差異，這與以往研究者報(bào)道的單加氧酶基因在非生物脅迫條件下表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的結(jié)果不一致，說明在不同植物中或者相同物種的不同品種之間，單加氧酶基因在非生物脅迫響應(yīng)過程中可能存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，單加氧酶基因在植物響應(yīng)非生物脅迫中的作用及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

CRISPR/Cas9 editing and expression analysis ofLOC_Os10g05490 in rice under cold stress

SHEN Chunxiu

(CollegeofLifeSciences，ResourcesandEnvironment，YichunUniversity，Yichun336000，China)

To explore the expression and cold tolerance function ofLOC_Os10g05490 in rice under cold stress， semi-quantitative analysis was performed for Dongxiang wild rice and 93-11. The results showed that expression level ofLOC_Os10g05490 in 93-11 was the same before and after cold stress， but it was down regulated in Dongxiang wild rice after cold stress. This was consistent with RNA-seq data and further study indicated that this gene might be associated with cold tolerance in Dongxiang wild rice. Plant expression vectors with CRISPR/Cas9 genome editing technique were subsequently constructed to target theLOC_Os10g05490 locus， and were transformed into thejaponicarice variety TP309. A total of 26 transgenic positive plants were obtained. This study may lay the foundation for subsequent screening of mutant plants and identification of genes associated with cold tolerance in rice.

cold stress; RNA-seq; Dongxiang wild rice; CRISPR/Cas9 genome editing technique

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.01

2016-09-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660379)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ151039)

沈春修(1979—)，男，湖南溆浦人，講師，博士，主要從事水稻抗逆性研究。E-mail: shenchunxiu@126.com

S511

A

1004-1524(2017)02-0177-09