育齡大熊貓陰道源乳酸桿菌的分離鑒定與系統進化

馬曉平，楊天意，俞 演，張志和，王承東，古 玉

(1.四川農業大學 動物醫學院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都611130； 2.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都610000； 3.中國保護大熊貓研究中心，四川 雅安 625000； 4.四川農業大學 生命科學學院，四川 雅安 625014)

育齡大熊貓陰道源乳酸桿菌的分離鑒定與系統進化

馬曉平1，楊天意1，俞 演1，張志和2，*，王承東3，古 玉4，*

(1.四川農業大學 動物醫學院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都611130； 2.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都610000； 3.中國保護大熊貓研究中心，四川 雅安 625000； 4.四川農業大學 生命科學學院，四川 雅安 625014)

旨在對大熊貓陰道源乳酸桿菌進行分離與鑒定。取發情期大熊貓陰道分泌物為試驗組，人陰道分泌物為對照組，對其乳酸桿菌進行分離培養，形態學、生化特性、16S rDNA特征鑒定及系統進化分析。結果顯示，通過API 50CHL系統鑒定生化特性，結合16S rDNA序列測定和系統進化分析，共分離到6株革蘭氏陽性乳酸桿菌，分別為從大熊貓陰道分泌物中分離到的唾液乳酸桿菌GPV01、植物乳酸桿菌GPV02和LactobacillussaerimneriGPV03，從對照組人陰道分泌物中分離得到嗜酸乳酸桿菌WAV01、卷曲乳酸桿菌WAV02和植物乳酸桿菌WAV03，大熊貓和人陰道中均存在植物乳酸桿菌(分別為GPV02和WAV03)。該結果可為后續研究大熊貓陰道乳酸桿菌生物學特性及開發大熊貓陰道益生菌奠定基礎。

大熊貓；陰道；乳酸桿菌；系統進化

大熊貓是現今世界上極其珍稀的大型哺乳動物之一，其以特殊的科學價值和獨特的觀賞價值為人們所喜歡，由于它的繁殖能力極低，種群數量少，雖然近年來大熊貓人工授精技術已取得顯著成果，但仍存在少數育齡大熊貓屢配不孕的情況[1]。陰道微生態的紊亂及細菌性陰道病與雌性育齡大熊貓屢配不孕有密切聯系[2]。正常陰道菌群與雌激素分泌水平等有關。其中乳酸桿菌是健康婦女陰道中的優勢菌群，陰道中95%以上的微生物是乳酸桿菌，它通過分泌H2O2、有機酸、細菌素及類細菌素等物質來發揮其益生菌功能，在陰道中承擔著維持陰道菌群平衡，調節陰道內環境穩定的作用[3]。本研究用非生理期育齡婦女陰道分泌物樣本作為對照，從發情期大熊貓陰道中取樣，對大熊貓和婦女陰道分泌物中的乳酸桿菌進行分離培養，并通過生化和分子生物學方法對其進行種屬的鑒定。以期為了解大熊貓生殖道微生態以及后期嘗試開發大熊貓陰道益生菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

2014年3—5月從中國保護大熊貓研究中心碧峰峽基地采集14只育齡、臨床健康，全身未使用抗生素及任何其他藥品的圈養雌性大熊貓(4～10歲)陰道分泌物樣本14份，并從5名非月經期女性(22～30歲)采集陰道分泌物樣本5份(由雅安市婦幼保健院幫助采樣)作為對照。

1.2 試驗儀器設備和試劑

PCR擴增儀(PE-2400，Perkin Applied Biosystems)；高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)；GelDoc XR+ BIO-RAD全自動凝膠成像系統(Bio-Rad,美國)；數碼照相裝置(Olympus DP70，日本)；電泳儀(JY600C，君意東方電泳設備有限公司)。細菌基因組和DNA提取試劑盒均購自TianGen公司，16S rDNA擴增引物由上海立菲生物公司合成，胰蛋白胨等試劑購自杭州微生物生化試劑有限公司。API 50CHL乳酸菌鑒定系統(梅里埃)。

1.3 試驗樣本的采集與處理

雌性育齡大熊貓自然發情后嘗試自然交配失敗，用鹽酸氯胺酮等對大熊貓麻醉后人工授精前，用無菌的棉拭子伸入大熊貓陰道蘸取分泌物，隨后立即放入裝有MRS肉湯培養基的EP管中恒溫保存，2 h內帶回實驗室，37 ℃厭氧增菌培養24 h。將無菌棉拭子伸入供試婦女陰道中，蘸取適量陰道分泌物后，立即放入裝有MRS肉湯培養基的EP管中恒溫保存，2 h內帶回實驗室，37 ℃厭氧增菌培養24 h。

1.4 乳酸桿菌的分離

普通固體MRS培養基的基礎上加2%的無水碳酸鈣，115 ℃滅菌 20 min，制作改良MRS固體平板。用接種環取大熊貓和人陰道分泌物增菌培養后的培養液分別劃線接種于改良MRS固體平板，37 ℃恒溫厭氧培養24～48 h，挑取不同形態的菌落進行純培養，革蘭氏染色鏡檢。選取G+無芽孢的桿菌為疑似菌株進行分子生物學鑒定和生理生化鑒定。

1.5 乳酸桿菌的鑒定

1.5.1 乳酸桿菌的試劑條鑒定

用乳酸菌鑒定系統API 50CHL鑒定初步分離到的G+無芽孢桿菌。用對數生長期菌體制備2McF的菌懸液接種于API 50CHL的試劑條記錄第一次結果。之后置于厭氧環境中37 ℃培養24 h，記錄第二次結果。再次置于厭氧環境下37 ℃培養24 h，記錄第三次結果，形成生化反應譜，將反應譜提交到代理公司經API軟件分析獲得結果。

1.5.2 乳酸桿菌的16S rDNA鑒定

挑取G+桿菌進行分子生物學鑒定，提取細菌基因組DNA作為模板進行16S rDNA PCR擴增，引物序列如下：16S F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；16S R:3’-GGTCTACCTTGTTACGACTT-5’陽性擴增產物送上海立菲生物技術有限公司測序，測序結果在GenBank 基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行比對。將測序獲得的16S rDNA序列與從GenBank數據庫中得到的相似性較高的序列(表1)用MEGA5.1軟件序列分析，同時繪制進化樹。

2 結果與分析

2.1 初步分離結果

本次共從14份樣本中分離得到3株乳酸桿菌(表2 中GPV01、GPV02、GPV03，圖2中的A、B、C)。健康人陰道分泌物樣本分離得到3株乳酸桿菌(表2中WAV01、WAV02、WAV03，如圖1中的D、E、F)。均僅在一個樣本中分離出1株乳酸桿菌。結果如圖1和表2。

表1 從GenBank中獲得的乳酸桿菌高相似性序列

Table 1 The sequences of high similarity toLactobacillusacquired from GenBank

編號No.菌種Species菌株號Strains序列注冊號GenBankaccessionNO.1Lactobacillussalivarius3-1-60AB9325312LactobacillussalivariusATCC11741AF0891083LactobacilluscrispatusJCM7697AB9114564LactobacillussaerimneriNBRC107826AB6260795LactobacillusplantarumDSM20205M588276LactobacillusbrevisATCC14869M588107LactobacilluscurieaeS1L19JQ0865508LactobacillusseniorisYIT12364AB6025709LactobacillussunkiiYIT11161AB36638510LactobacillusotakiensisYIT11163AB36638611Lactobacillussp.JKD6AF26470112LactobacillusfarraginisNRIC0676AB26273113LactobacillusjenseniiATCC25258AF24317614LactobacilluscrispatusJCM7702AB91145915LactobacillushelveticusDSM20075AM11377916LactobacillusacidophilusCMUL67KF73866916LactobacillusacidophilusCMUL67KF738669

表2 不同樣本乳酸桿菌初步分離結果

Table 2 Preliminary separation results ofLactobacillusisolated from different samples

樣本編號SampleID菌株數Strainnumber編號StrainserialnumberCC1GPV01ZM1GPV02WJ1GPV03WOMAN-11WAV01WOMAN-21WAV02WOMAN-31WAV03

GPV 代表菌株從大熊貓陰道分泌物中分離得到；WAV代表菌株從婦女陰道分泌物中分離得到；01、02、03表示分離到的第幾株。

GPV represents vaginal secretions of giant panda; WAV represents vaginal secretions of women; 01， 02， 03 represent number of strain.

2.2 生理生化鑒定結果

對分離到的6株疑似乳酸桿菌，采用API 50 CHL系統進行生理生化鑒定，生化反應譜見表3。其鑒定ID值在85以上為可接受結果，在85以下為不確定結果。本次分離到的6株乳酸桿菌可初步鑒定到種，其鑒定反應譜見表3。將生理生化特性結果輸入API 50CHL鑒定系統比對后初步鑒定結果：GPV01為唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)，GPV02為植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)，GPV03為發酵乳酸桿菌(Lactobacillusfermenti)，WAV01為嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)，WAV02為卷曲乳酸桿菌(Lactobacilluscrispatus)，WAV03為植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)。

A， GPV01; B， GPV02; C. GPV03; D， WAV01; E， WAV02; F， WAV03. Gram staining. The magnification is 1 000 times圖1 分離的6種細菌形態和革蘭氏染色特性Fig.1 Morphology and Gram’s stain characteristics of the 6 bacterial

表3 乳酸桿菌生化鑒定反應譜

Table 3 Identification ofLactobacillusbased on physiological and biochemical characteristics

測試項目TestitemGPV01GPV02GPV03WAV01WAV02WAV03空白對照Blankcontrol------甘油Glycerinum------赤癬醇Erythritol------D-阿拉伯糖D-(-)-Arabinose------L-阿拉伯糖L-Arabinose--+--+/-核糖Ribose-+----D-木糖D-xylose------L-木糖L-xylose------阿東醇Adonit------β-甲基-D-木糖甙β-methyl-D-xyloseglycoside------半乳糖Galactose++/-++/-+/-+葡萄糖Glucose++++++果糖Fructose++++++甘露糖Mannose+++++/-+山梨糖Sorbose------鼠李糖Rhamnose+/------衛茅醇Dulcitol------肌醇Inositol------甘露醇Mannitol++---+山梨醇Sorbitol+----+α-甲基-D-甘露糖甙α-methyl-D-mannoseglucoside-----+α-甲基-D-葡萄糖甙α-methyl-D-glucoseglucoside------N-乙酰-葡糖胺N-acetylglucosamine++-+/-++苦杏仁甙Amygdalin-+-+/-+/-+熊果甙Arbutin-+/--+/-+/-+七葉靈Esculin-+/-++++柳醇Salicin-+/--+++纖維二糖Cellobiose-+/--+++麥芽糖Maltose++++++乳糖Lactose++/-++/-+/-+蜜二糖Melibiose+-+-+/-+蔗糖Sucrose+-++++海藻糖Trehalose---+/-+/-+菊糖Synanthrin------松叁糖Melezitose+----+棉子糖Raffinose--+-+/--淀粉Starch----+-糖原Glycogen----+/--木糖醇Xylitol------攏牛兒糖Geraniol-+-+--D-松二糖D-(+)-Turanose-----+D-來蘇糖D-(-)-Lyxose------D-塔格糖D-(-)-Tagatose------D-巖糖D-fucose------L-巖糖L-fucose------D-阿拉伯糖醇D-arabitol------L-阿拉伯糖醇L-arabitol------葡萄糖酸鹽Gluconate-----+2-酮基-葡萄糖酸鹽2-keto-gluconate------5-酮基-葡萄糖酸鹽5-keto-gluconate------

+，陽性反應；-，陰性反應；+/-，介于陽性與陰性之間。

+， Positive reaction; -， Negative reaction; +/-， Interposed between the positive and negative.

2.3 16S rDNA 鑒定結果

對疑似的乳酸桿菌進行純培養，然后按照DNA提取試劑盒說明書提取純培養物DNA，選取細菌通用引物進行16S rDNA擴增，擴增結果如圖2所示。

將擴增產物送上海立菲生物技術有限公司測序，測序結果在GenBank(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)中進行比對(表4)。本次共分離得到6株乳酸桿菌(其核酸序列提交http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ 分別獲得如下序列號，KR072513、KR072514、KR072515、KR072516、KR072517、KR072518)，結合形態學、生理生化鑒定、分子生物學鑒定的結果，6株乳酸桿菌的最終鑒定結果為：GPV01為唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)，GPV02為植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)，GPV03為Lactobacillussaerimneri，WAV01為嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)，WAV02為卷曲乳酸桿菌(Lactobacilluscrispatus)，WAV03為植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)。選取與其同源性最高的乳酸桿菌核酸序列進行同源性分析，構建neighbor-joining(NJ)進化樹(圖3)。從圖中可見，6株乳酸桿菌均與GenBank中的同種的菌株序列達到99%以上同源性，表明分離到的菌株確為對應種的乳酸桿菌。

M，Marker；GPV01、GPV02、GPV03，大熊貓樣本；WAV01、WAV02、WAV03，人樣本。M， Marker; GPV01， GPV02， GPV03 are from giant panda; WAV01， WAV02， WAV03 are from women.圖2 16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR products of 16S rDNA

3 討論

對于微生物的分類鑒定，傳統的鑒定方法是通過其形態學、生理生化、細胞組成等進行鑒定。目前，已研究發現乳酸桿菌屬包括了102個種，種與種之間的生理生化反應和遺傳結構都有很大程度上的相似性，使得對乳酸桿菌的分類鑒定較為困難。單獨依靠表型的方法來鑒定乳酸桿菌是不客觀的，還需結合分子生物學鑒定方法。細菌的16S rDNA在細菌的進化中具有高度的保守性，被認為是細菌分子的“活化石”， 但仍存在9～10個變異區使得不同種屬的細菌間有著一定的差異，這也就成了細菌分類的標志[4]。為此，本文選取API 50 CHL試劑條，結合分子生物學方法進行鑒定。API 50 CHL試劑條是由49種可發酵碳水化合物的API 50 CHL試劑條組成的簡易培養基[5]。將待測菌制成懸液接種于試劑條的每個小管中。當培養時，由于發酵碳水化合物產酸，pH下降，使指示劑變色[6]，結果生成菌株的生化反應譜，并用于鑒定或分型。

表4 六株疑似乳酸桿菌的比對結果

Table 4 Sequence comparison of the 6Lactobacillusstrains

菌株編號Strainnumber參考菌株Referencestrain相似性Similarity登錄號AccessionnumberGPV01LactobacillussalivariusstrainCH-999%KR072514GPV02LactobacillusplantarumstrainPro34100%KR072513GPV03LactobacillussaerimneristrainGDA15499%KR072515WAV01LactobacillusacidophilusstrainFSI499%KR072516WAV02LactobacilluscrispatusstrainLE1099%KR072517WAV03LactobacillusplantarumstrainLp-C6399%KR072518

圖3 基于16S rDNA核酸序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 6 Lactobacillus strains based on the 16S rDNA sequence

本試驗共分離鑒定大熊貓陰道源乳酸桿菌3株，大熊貓和人陰道中均有乳酸桿菌且有相同種的乳酸桿菌。唾液乳酸桿菌GPV01、植物乳酸桿菌GPV02、嗜酸乳酸桿菌WAV01、卷曲乳酸桿菌WAV02和植物乳酸桿菌WAV03的生化鑒定結果與分子生物學鑒定結果一致，但GPV03在對數生長期進行了3次生理生化鑒定，均為發酵乳酸桿菌，而用分子生物學方法鑒定為L.saerimneri。因為生理生化鑒定的很多指標受細菌狀態、活力等諸多相關因素的影響，故結果可能會從陽性變為陰性。該實驗中GPV03的生理生化鑒定結果和分子生物學方法鑒定結果的不一致，可能是由此原因導致。細菌16S rDNA基因序列由保守區和可變區互相交錯排列組成。編碼基因具有高度的保守性，現有細菌DNA均由其上一代遺傳下來。雖然在長期的進化過程中，細菌的基因會因為突變而有較大變化，但其祖先的某些痕跡仍留在其核苷酸序列中[7]。故經由16S rDNA基因序列做成的鑒定結果更為可信，故將GPV03鑒定為L.saerimneri。雷蕾等[8]，胡國全等[1]分別對9只和2只大熊貓陰道棉拭子進行分離培養，均認為乳酸桿菌是大熊貓陰道中的優勢菌群。筆者前期采用454高通量測序對21只發情期雌性大熊貓陰道分泌物進行微生物多樣性研究表明，大熊貓陰道的優勢菌群是乳球菌屬和腸球菌菌屬，乳酸桿菌屬只占0.01%，不是大熊貓陰道內優勢菌群[9]。而本研究從14只大熊貓陰道分泌物中共分離得到3株乳酸桿菌，其分離率較低(3/14，21.4%)，與前期的高通量測序研究結果較為一致。乳酸桿菌是健康婦女陰道中的優勢菌群，從健康女性的陰道排出物標本中分離率高達80%～100%[10]。本研究從5位健康成年女性陰道分泌物分離到3株乳酸桿菌，雖然分離率明顯高于大熊貓陰道樣本，但是其分離菌株明顯較少。肖冰冰等[10]對不同年齡、不同生活習慣的女性進行陰道乳酸桿菌的分離，發現年齡越大，生活習慣差的女性其陰道乳酸桿菌的數量很少。不同地區的女性陰道乳酸桿菌分布情況有所不同，例如存在于西方女性陰道內的嗜酸乳酸桿菌 (Lactobacillusacidphilus)，并未在韓國女性陰道內發現，同時在韓國女性陰道內卻找到了不存在于西方女性陰道內的鼠李糖乳酸桿菌，印度健康女性陰道內的優勢菌為羅伊乳酸桿菌(LactobacillusIreuteri)、發酵乳酸桿菌和唾液乳酸桿菌(Lactobacillusalivarius)[11]。同理，不同地區不同飼養環境以及不同生理狀態下的大熊貓，其陰道微生物的種類和數量不同。因為陰道微生態處于一個動態平衡。同時生殖道菌群組成受個體年齡、遺傳背景、用藥情況、激素水平和性行為等因素影響[3]。

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(責任編輯 盧福莊)

Isolation, identification and phylogenetic analysis ofLactobacillusfrom vagina of giant panda

MA Xiaoping1， YANG Tianyi1， YU Yan1， ZHANG Zhihe2,*， WANG Chengdong3， GU Yu4，*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China; 2.ChengduResearchBaseofGiantPandaBreeding，Chengdu610000，China; 3.ChinaConservationandResearchCenterfortheGiantPanda，Ya’an625000，China; 4.CollegeofLifeScience，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

In order to separate and identify theLactobacillusfrom vagina of giant panda， the vaginal secretions were taken from estrus female giant panda and women. The isolatedLactobacillusstrains were identified by morphology， biochemical characteristics， 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis. The results showed that a total of 6 gram-positiveLactobacillusstrains were obtained.LactobacillussalivariusGPV01，LactobacillusplantarumGPV02，LactobacillussaerimneriGPV03 were isolated from the vaginal secretion of the giant panda (test group)， andLactobacillusacidophilusWAV01，LactobacilluscrispatusWAV02，LactobacillusplantarumWAV03 were isolated from the vaginal secretion of the woman (control group). It was interesting that the giant panda and woman all hadL.plantarumin the vagina (GPV02 and WAV03). This result would lay the foundation for studying biological property of vaginaLactobacillusof giant panda and exploiting vaginal probiotics for giant panda.

giant panda; vagina;Lactobacillus; phylogenetics

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.03

2016-07-19

國家科技支撐計劃項目(2012BAC01B06)；四川省科技廳基礎研究計劃項目(2013JY0175)；大熊貓國際資金項目(AD1415)

馬曉平(1976—),男，土家族，重慶石柱人，博士，副教授，從事臨床獸醫學的教學科研工作。E-mail：mxp886@sicau.edu.cn

*通信作者，古玉，E-mail：guyu632@sicau.edu.cn；張志和，E-mail:zzh@panda.org.cn

S858.9；Q955

A

1004-1524(2017)02-0193-07