五苓散對(duì)實(shí)驗(yàn)性銅中毒大鼠的治療作用

程 顏，劉亞云，張方潔，黃翠華，康佑汐，韓春楊，陳玎玎，劉翠艷，*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)中心，安徽 合肥 230036)

五苓散對(duì)實(shí)驗(yàn)性銅中毒大鼠的治療作用

程 顏1，劉亞云1，張方潔1，黃翠華1，康佑汐1，韓春楊1，陳玎玎2，*，劉翠艷1，*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)中心，安徽 合肥 230036)

為探討中藥利濕方劑五苓散對(duì)動(dòng)物體內(nèi)銅排泄的影響，通過(guò)飼喂高銅飼料建立SD大鼠亞慢性銅中毒病理模型，然后用五苓散進(jìn)行治療。分別在造模成功和治療結(jié)束時(shí)進(jìn)行心臟采血，火焰原子吸收法測(cè)定大鼠血液銅含量，試劑盒法測(cè)定血清中AST、LDH和SOD的活性；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖殺大鼠，觀察內(nèi)臟器官的病理變化，并取肝臟、腎臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。造模結(jié)束時(shí)檢查發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度減緩，肝臟和腎臟出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化，血液銅含量極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。采用五苓散治療后，與模型組比較，治療組大鼠肝腎病理學(xué)變化明顯減輕，血液中銅含量顯著降低(P<0.05)；SOD活性升高(P<0.05)，AST和LDH活性降低(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，治療組大鼠上述指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，五苓散能有效促進(jìn)銅中毒大鼠體內(nèi)銅的排泄，減輕肝、腎組織損傷，可用于臨床動(dòng)物亞慢性銅中毒的治療。

五苓散；大鼠；銅中毒；治療

銅是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一，其最重要的生理作用是作為金屬酶的組成部分參與體內(nèi)代謝，在保證動(dòng)物健康生長(zhǎng)和提高生產(chǎn)力方面起著不可替代的作用。自1955年Barber等[1]提出“在生長(zhǎng)肥育豬的日糧中添加高于正常生理需要數(shù)10倍量的銅可促進(jìn)生長(zhǎng)及改進(jìn)飼料利用率”后，銅開(kāi)始作為一種畜禽促生長(zhǎng)劑被廣泛使用，而且其使用劑量往往超出畜禽本身最大耐受量。不可忽視的是，銅還是一種有毒元素，美國(guó)EPA(美國(guó)環(huán)境保護(hù)署)將銅列為第4類(lèi)優(yōu)先考慮的毒性元素。長(zhǎng)期使用高銅飼料，除了可能引起動(dòng)物銅中毒外，還會(huì)因高銅降低鋅和鐵的吸收，從而引起鋅和鐵的缺乏，導(dǎo)致動(dòng)物肝、腎中銅殘留量顯著增加，從而影響動(dòng)物性食品安全，危害人類(lèi)健康。因此，除了制定法令法規(guī)限制銅在飼料中的使用外，促進(jìn)動(dòng)物體排銅也是一個(gè)重要方面。

目前，對(duì)于食用動(dòng)物慢性銅中毒基本不治療，國(guó)外有報(bào)道稱(chēng)醋酸鋅是一種有效、無(wú)毒的治療犬銅中毒的藥物[2]。在人醫(yī)臨床上，銅中毒病人的搶救除支持療法和對(duì)癥治療外，主要用二巰基丙磺酸鈉和青霉胺進(jìn)行治療或采用白蛋白透析[3]，但這些方法目前在獸醫(yī)臨床上尚未采用。另外，西藥治療多為對(duì)癥治療，需要不同藥物的相互作用，從而增加機(jī)體代謝負(fù)擔(dān)；有時(shí)還導(dǎo)致機(jī)體對(duì)其他元素的攝入量增加，而銅中毒時(shí)機(jī)體本身對(duì)這些元素的代謝是降低的，從而導(dǎo)致其他疾病發(fā)生的概率增大[4]。中藥源于天然，毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性；而且中藥治病不僅僅是治療某一種病癥，更重視機(jī)體內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)，因而更適合人和動(dòng)物疾病的治療。中藥方劑五苓散具有溫陽(yáng)化氣、利濕行水的功效，與銅中毒證治相合，可用于銅中毒的治療，但目前有關(guān)中藥排泄重金屬的研究和應(yīng)用還不夠廣泛和深入，因此本研究嘗試采用利濕方劑五苓散對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性銅中毒進(jìn)行治療，以期為醫(yī)學(xué)尤其是獸醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠30只，雄性，5周齡，體質(zhì)量(100 ± 5)g，購(gòu)自江蘇愛(ài)爾麥特科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(蘇)2014-0007。

1.2 主要試劑與儀器

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒：均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；銅標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1 000 mg·L-1)：購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；硝酸、高氯酸為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水為電阻值18.2 MΩ的超純水。

BSA124S-CW型電子分析天平，由北京賽多利斯有限公司生產(chǎn)；CelercareV1型全自動(dòng)生化分析儀，由天津微納芯科技有限公司生產(chǎn)；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，由上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；BA200型數(shù)碼顯微鏡，由廈門(mén)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；石蠟切片機(jī)，由德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；ZEEnit700P原子吸收光譜儀，由德國(guó)耶拿公司生產(chǎn)。

采樣瓶與分析器具處理：采集水樣的聚乙烯塑料瓶及實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿必須用洗滌劑洗凈后，在硝酸溶液中浸泡，反復(fù)沖洗，使用前用去離子水潤(rùn)洗1～2次。

1.3 SD大鼠慢性銅中毒模型的建立及五苓散治療試驗(yàn)

1.3.1 五苓散水煎液的制備

取干燥的五苓散飲片128 g(豬苓、澤瀉、白術(shù)、茯苓、桂枝的質(zhì)量比為3∶5∶3∶3∶2)，制成粗粉；加8倍量去離子水浸泡40 min；武火煮沸后，改用文火，保持微沸40 min；紗布過(guò)濾；藥渣再加5倍量溫水煎煮，小火保持微沸30 min，過(guò)濾；合并2次煎液，958g離心15 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至256 mL(相當(dāng)于含生藥0.5 g·mL-1)，高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 處理設(shè)計(jì)

將30只大鼠隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組、模型組和五苓散治療組，每組10只。對(duì)照組飼喂普通飼料，模型組和五苓散治療組飼喂高銅飼料(Cu含量700 mg·kg-1)，連續(xù)飼喂28 d，期間自由飲水。每天記錄各組大鼠的精神狀況、形態(tài)體征、采食飲水情況等，每周稱(chēng)量體質(zhì)量1次。造模成功后，治療組按每kg體質(zhì)量3.125 g的劑量(此為前期摸索出的最佳劑量)給大鼠灌胃五苓散煎液，對(duì)照組和模型組給予等量去離子水，每天2次，連續(xù)10 d。

1.3.3 樣品采集

大鼠于最后1次給藥后禁食12 h，不禁水。實(shí)驗(yàn)時(shí)先稱(chēng)量，再以乙醚吸入麻醉，心臟采血，收集3 mL抗凝血，2 mL非抗凝血；然后頸椎脫臼處死大鼠，進(jìn)行病理剖檢，觀察內(nèi)臟器官的變化，并取肝、腎等組織，以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)固定。

1.3.4 火焰原子吸收分光光度法檢測(cè)大鼠全血銅含量

(1)血樣前處理。準(zhǔn)確吸取2 mL待檢全血于50 mL燒杯中，加入8 mL硝酸和2 mL高氯酸，充分混勻，加蓋表面皿，置于60 ℃烘箱內(nèi)過(guò)夜。次日于電熱板上加熱消解，直至清亮透明冒白煙，再進(jìn)一步消煮至盡干。取下燒杯，冷卻，用超純水定容至10 mL，待測(cè)。同時(shí)進(jìn)行空白樣品的處理。

(2)銅標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。吸取銅標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，用0.5%的硝酸定容至100 mL，制得濃度為10 mg·L-1的銅標(biāo)準(zhǔn)中間液。再?gòu)闹蟹謩e吸取1、3、5、7、9 mL，定容至100 mL，即獲得0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

(3)原子吸收光譜儀的工作條件。分析波長(zhǎng)：24.8 nm；燈電流：3 mA；狹縫寬度：1.2 nm；原子化方式：火焰；火焰類(lèi)型：C2H2/Air；火焰高度：6 nm。

1.3.5 大鼠血清SOD、AST、LDH活力測(cè)定

將全血樣品958g離心20 min，分離血清。按試劑盒說(shuō)明書(shū)，用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清樣品中SOD、AST、LDH的活性測(cè)定。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.3.6 肝、腎組織的病理學(xué)觀察

將固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中的肝臟、腎臟等組織，進(jìn)行石蠟切片，HE常規(guī)染色，顯微鏡觀察其組織學(xué)變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19. 0 軟件包中多因素方差分析及Duncan法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀觀察及體質(zhì)量變化

隨著高銅飼料喂飼時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠表現(xiàn)為形體消瘦、被毛焦燥、顏色發(fā)黃。在體質(zhì)量方面，對(duì)照組和模型組大鼠初質(zhì)量均為(100 ± 5) g，第1周稱(chēng)量?jī)山M體質(zhì)量差異不明顯(P>0.05)，第2周至第4周稱(chēng)量?jī)山M體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度較正常對(duì)照組明顯減慢(表1)。

2.2 病理剖檢

模型組大鼠：肝均質(zhì)脆，發(fā)黃，腫脹明顯；腎臟腫脹，呈巧克力色；肺部有充血；腸道中的糞便稀薄發(fā)綠。

治療組大鼠：肝臟略黃，腫脹不明顯；腎臟稍軟，略腫或不腫；肺和腸道未見(jiàn)明顯異常。

表1 大鼠喂高銅飼料期間體質(zhì)量變化

Table 1 The changes of body weight of rats in two groups after treated with different level of Cu g

同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. The same as bellow.

2.3 血液中銅含量測(cè)定

2.3.1 造模結(jié)束時(shí)對(duì)照組、模型組大鼠血液中銅含量的變化

造模結(jié)束時(shí)，模型組大鼠血液銅含量為(1.058±0.019) μg·g-1，顯著高于對(duì)照組大鼠血液銅含量(0.793±0.112)μg·g-1(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。

2.3.2 五苓散治療后各組大鼠血液中銅含量的變化

由表2可知，用五苓散治療后，治療組大鼠血液中銅含量顯著低于模型組(P<0.05)，而與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明五苓散對(duì)大鼠體內(nèi)銅排泄有顯著作用。另外，模型組大鼠血液中銅含量在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)也比造模結(jié)束時(shí)有所降低，是大鼠正常代謝的結(jié)果。

表2 五苓散治療后各組大鼠血液中銅含量的變化

Table 2 The changes of Cu content in blood of rats in three groups after treatment μg·g-1

2.4 五苓散治療后各組大鼠血清中SOD、AST、LDH活性的變化

由表3可知，與模型組相比，泊療組大鼠血清中SOD活性顯著升高(P<0.05)，AST和LDH活性顯著降低(P<0.05)；而與對(duì)照組相比，SOD、AST和LDH活性均差異不顯著(P>0.05)。

表3 五苓散治療后各組大鼠血清中SOD、AST、LDH活性變化

Table 3 The Changes of SOD， AST and LDH activeties in rat serum after Wuling San treatment U·L-1

2.5 肝、腎組織學(xué)檢查結(jié)果

通過(guò)HE染色觀察肝臟和腎臟組織的病理變化，結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠肝小葉、門(mén)靜脈等結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)正常肝組織結(jié)構(gòu)(圖1-A)；腎臟結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理變化(圖1-D)。模型組大鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性，存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維增生，胞漿內(nèi)有明顯的蛋白質(zhì)顆粒，核固縮顯著，大部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失(圖1-B)；腎臟細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，部分細(xì)胞壞死、脫落，腎小管擴(kuò)張，存在間質(zhì)纖維化(圖1-E)。治療組大鼠肝臟存在輕微的脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)完整(圖1-C)；腎臟少量細(xì)胞壞死、脫落，結(jié)構(gòu)完整(圖1-F)。

3 討論

3.1 銅在動(dòng)物體內(nèi)的代謝及對(duì)機(jī)體的損傷

研究表明，從消化道攝入的銅在動(dòng)物體內(nèi)的吸收部位主要是十二指腸和小腸近端，部分銅的吸收也可發(fā)生在小腸遠(yuǎn)端，一些通過(guò)膽汁排出的銅，經(jīng)肝腸循環(huán)再回收利用進(jìn)入血液后被運(yùn)送到全身各處。銅被吸收后主要分布在肝臟、腎臟、腦、心臟、毛發(fā)中，而肝臟不僅是銅的貯庫(kù)，也是銅代謝的重要器官[5]。過(guò)量的銅集聚在肝細(xì)胞核、線粒體及肝漿液中，損傷這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制多種酶的活性，使谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、血漿精氨酸酶(ARG)及血漿膽紅素含量升高，導(dǎo)致肝功能障礙；當(dāng)肝臟進(jìn)一步受到損傷，銅就會(huì)被大量釋放入血，使血銅含量升高。血銅進(jìn)入紅細(xì)胞，可使紅細(xì)胞脆性增加而發(fā)生血管內(nèi)溶血，繼而導(dǎo)致貧血和血紅蛋白尿、紅細(xì)胞形態(tài)變化異常等。出現(xiàn)溶血時(shí)，腎銅濃度升高，腎小管被血紅蛋白阻塞，從而引起腎單位壞死、腎功能衰竭、血紅蛋白尿，甚至尿毒癥，嚴(yán)重者骨骼肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[6]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠形體消瘦、被毛焦燥、顏色發(fā)黃；肝質(zhì)脆、發(fā)黃、腫脹明顯，腎臟腫脹、呈巧克力色；SOD活性較對(duì)照組為低，AST、LDH則活性顯著升高。五苓散治療組大鼠肝臟略黃、腫脹不明顯，腎臟稍軟、略腫或不腫； SOD活性較對(duì)照組、模型組顯著上升，AST、LDH活性則顯著低于模型組，與對(duì)照組差異均不顯著。說(shuō)明五苓散能有效緩解銅中毒引起的肝、腎損傷，對(duì)體內(nèi)蓄積的銅有較好的排泄作用。

A、B、C，分別為對(duì)照組、模型組、五苓散治療組肝臟組織(HE染色，×40)；D、E、F，分別為對(duì)照組、模型組、五苓散治療組腎臟組織(HE染色，×200)A， B， C were live tissues in control group， model group and treatment group， respectively; D， E， F were kindney tissues in control group， model group and treatment group，respectively (HE ×200)圖1 大鼠肝臟和腎臟組織的病理學(xué)變化Fig.1 Pathological changes of liver and kidney tissues in rats

3.2 五苓散排銅的理論依據(jù)

中醫(yī)認(rèn)為，銅中毒屬銅毒內(nèi)蘊(yùn)、濕熱火毒內(nèi)擾之證。銅濁毒邪蓄積于肝腎，造成肝腎氣滯血結(jié)，脈絡(luò)壅塞，正氣耗傷，痰瘀留滯，水濕不化而成鼓脹[7]。源于東漢末年名醫(yī)張仲景《傷寒雜病論》的五苓散，為太陽(yáng)病表里雙解法代表方之一，其組成為茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術(shù)(炒)，具有溫陽(yáng)化氣、利濕行水之功效，可治療機(jī)體氣化不利、水飲內(nèi)停等證；其在外可解表，在內(nèi)健脾化氣利水，使人之水液代謝重歸平衡[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，五苓散能利水利尿、保護(hù)腎肝[9-10]，可用于腎小球腎炎、肝硬化腹水、急慢性腎炎等見(jiàn)水腫、少尿者[11]。由此看來(lái)，五苓散對(duì)應(yīng)的主證與銅中毒病機(jī)相吻合。

3.3 五苓散各組成藥味(茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術(shù))的利尿保肝作用

茯苓，具有化濕利水、通調(diào)下焦水道的作用，其中的茯苓素因拮抗醛固酮而產(chǎn)生利尿作用，而茯苓多糖則能增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保肝、促進(jìn)造血等[12-13]；澤瀉，通小便、泄膀胱熱、調(diào)節(jié)機(jī)體水液代謝等作用顯著，其中的三萜類(lèi)成分和澤瀉醇等有效成分不但具有利尿作用，而且還能有效改善肝功能[14]；豬苓，專(zhuān)功利水，可入下焦消除腫滿，與茯苓、澤瀉配伍時(shí)還能加強(qiáng)利水袪濕作用，其中的麥角甾醇及VB等有利尿作用，還能清除自由基、治療肝炎[15-16]；桂枝，具有溫通經(jīng)脈，助陽(yáng)化氣等功效，可輔肺臟行水、使膀胱通暢，其中的揮發(fā)油能通過(guò)促進(jìn)SOD活性來(lái)抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)機(jī)體的損傷[17]；白術(shù)，益氣健脾、燥濕利水，其中的揮發(fā)性成分蒼術(shù)酮通過(guò)抑制鈉鉀 ATP酶的活性發(fā)揮利尿作用，白術(shù)內(nèi)酯則通過(guò)改善氧化應(yīng)激造成的損傷以及調(diào)節(jié)炎性因子的水平來(lái)改善腎組織損傷，是白術(shù)中具有抑制炎癥反應(yīng)的活性成分[18-19]。可見(jiàn)，五苓散中的諸多有效成分是通過(guò)利尿作用來(lái)加速體內(nèi)銅的排泄，通過(guò)抗炎、抗氧化來(lái)保肝護(hù)腎，從而修復(fù)銅在體內(nèi)蓄積而造成的損傷。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Effect of Wuling San on copper poisoning in experimental rats

CHENG Yan1， LIU Yayun1， ZHANG Fangjie1， HUANG Cuihua1， KANG Youxi1， HAN Chunyang1， CHEN Dingding2，*， LIU Cuiyan1，*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China; 2.BiotechnologyCenter，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

In order to investigate the effects of Wuling San， a Chinese herbal medicine compound powder with promoting diuresis， on the copper excretion in animal， the pathological model of subchronic copper poisoning in SD rats was established by feeding high copper diet， and then Wuling San as a therapeutic drug was given by means of intragastric administration to rats. After the success of building models and at the end of treatment， the blood sample of rats was collected by cardiac puncture for determining copper content with the method of flame atomic absorption spectrometry， and the activities of serum AST， LDH and SOD were detected by reagent kit. At the end of the experiment， all the rats were anatomized to observe the changes of pathologic autopsy of the internal organs， and the histopathologic changes of liver and kidney. Results showed that compared with control group， the rats of the model group were slow in velocity of body weight increasement， the obvious pathological changes of liver and kidney structure were found and the level of blood copper was significantly higher (P<0.01)， indicating that the model of subchronic copper poisoning in rats was successfully established. After treated with Wuling San， compared with model group， the treatment group had less detectable changes in histopathology， the level of blood copper was significantly lower (P<0.05)， SOD activity increased (P<0.05) and AST and LDH activities declined (P<0.05). The above five indexes had no significant differences between the treatment group and the control group (P<0.05). The results of this study indicated that Wuling San could effectively promote the excretion of copper in rats， alleviate the damage of liver and kidney， so it could be used to treat clinical subchronic copper poisoning of animals.

Wuling San; rat; copper poisoning; therapy

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.05

2016-09-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31172358)；2015年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201510364008)

程顏(1995—)，女，安徽宣城人，本科生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail: 410150915@qq.com

*通信作者，陳玎玎，E-mail: dingding0626@126.com；劉翠艷，E-mail:cyliu@ahau.edu.cn

S853.91

A

1004-1524(2017)02-0206-07