A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC結(jié)構(gòu)分析與生物學活性鑒定

許崇利，許崇波，宮語晨

(1.吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林132022； 2.韶關(guān)學院 英東生命科學院，粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關(guān)512005； 3.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118)

A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC結(jié)構(gòu)分析與生物學活性鑒定

許崇利1，許崇波2，*，宮語晨3

(1.吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林132022； 2.韶關(guān)學院 英東生命科學院，粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關(guān)512005； 3.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118)

利用PCR擴增技術(shù)克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因，構(gòu)建含PLC1-250基因表達質(zhì)粒的BL21(DE3)(pN-PLC1-250)重組菌株，序列分析和酶切鑒定證實構(gòu)建的pN-PLC1-250重組質(zhì)粒含有目的基因且基因序列與閱讀框架均正確。SDS-PAGE分析表明，PLC1-250蛋白表達量占菌體總蛋白相對含量的18.76%。利用SOPMA法預(yù)測PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)，且同源模建了其3D結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，三級結(jié)構(gòu)與α毒素相類似。此外，還對其生物學活性進行了鑒定，可為進一步探索α毒素作用的分子機制，以及其分子結(jié)構(gòu)與生物學功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

A型魏氏梭菌；α毒素PLC基因；生物學活性；圓二色光譜

A型魏氏梭菌(Clostridiumwelchiitype A)是引起人類食物中毒、氣性壞疽和腸毒血癥等腸道性疾病的主要病原菌，其分泌的α毒素由370個氨基酸組成，是A型魏氏梭菌主要的致病因子。α毒素具有溶血性、細胞毒性、皮膚壞死性和致死性等生物學特性[1-2]。研究表明，α毒素氨基端具有磷脂酶C(PLC)活性，可水解細胞膜的主要成分——磷脂酰膽堿。α毒素羧基端對于α毒素氨基端的生物學活性具有重要影響，其結(jié)構(gòu)域?qū)τ讦炼舅亟Y(jié)合細胞膜至關(guān)重要[3-4]。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，α毒素的酶活性部位包括催化位點和結(jié)合位點，其結(jié)構(gòu)包括由9個α螺旋和1個活性位點組成的氨基端和由8個反平行的β折疊組成的羧基端[5]。α毒素的酶活性依賴于金屬離子Zn2+，主要結(jié)合位點是第56位的天冬氨酸，同時該位點也是其催化位點。Nagahama等[6]利用定點突變技術(shù)證實α毒素的某些氨基酸殘基會影響其生物學活性。Stevens等[7]和Nagahama等[8-9]構(gòu)建了1～249氨基酸的α毒素氨基端，該片段保留了磷脂酶C活性。這些研究雖然證實α毒素氨基端具有磷脂酶C活性，但對于α毒素分子結(jié)構(gòu)與生物學活性之間的關(guān)系并未進行深入的研究。本研究擬對α毒素氨基端PLC1-250基因進行表達，預(yù)測其蛋白二級結(jié)構(gòu)，同源模建其3D結(jié)構(gòu)，并測定PLC1-250蛋白的圓二色光譜，探索PLC1-250蛋白的生物學活性，以期為進一步研究α毒素分子結(jié)構(gòu)與生物學功能的關(guān)系及其分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體和菌株

BL21(DE3)菌株和pET-32a購自Novagen公司；重組菌株BL21(DE3)(pXETA02)由韶關(guān)學院許崇波教授惠贈；活性檢測用的小鼠購自吉林大學實驗動物中心。

1.2 試劑

QDL2000 DNA分子量標記、ExTaq酶、T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ)和IPTG購自寶生物工程有限公司；氨芐西林(Amp)和卡那霉素購自Sigma公司；Wizard PCR preps DNA Purification System購自Promega公司。

1.3 表達質(zhì)粒pN-PLC1-250的構(gòu)建

根據(jù)Titball等[10]報道的PLC1-250基因序列設(shè)計PCR擴增引物并合成，引物序列為：上游引物P1，5′-CATGCCATGGCATGGGATGGAAAGATTGAT-3′，下游引物P2，5′-CCGGAATTCTGATGGATCATTACCCTC-3′。上游引物和下游引物分別含EcoRⅠ和NcoⅠ的酶切位點及保護性堿基。利用這對PCR引物從重組質(zhì)粒pXETA02擴增出α毒素氨基端PLC1-250基因片段。參照文獻[11]的方法，NcoⅠ和EcoRⅠ分別酶切PCR產(chǎn)物和pET-32a載體，16 ℃ T4DNA連接酶連接過夜。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，利用Amp抗性篩選出陽性克隆，提取重組表達質(zhì)粒pN-PLC1-250，并進行酶切鑒定和測序。

1.4 pN-PLC1-250表達及SDS-PAGE分析

按文獻[11]報道的方法進行。

1.5 α毒素和PLC1-250蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

按Geourjon等[12]介紹的方法，在EXPASY服務(wù)器(http://www. expasy. org/ tools)上利用SOPMA法預(yù)測α毒素和PLC1-250蛋白二級結(jié)構(gòu)。

1.6 α毒素和PLC1-250蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測

以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)提供的α毒素三維結(jié)晶結(jié)構(gòu)(3D)為模板，使用EXPASY服務(wù)器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)對α毒素和PLC1-250蛋白3D結(jié)構(gòu)進行同源模型構(gòu)建，并用Rasmol軟件繪制其3D結(jié)構(gòu)圖[13]。

1.7 α毒素和PLC1-250蛋白分子的圓二色譜分析

使用J810-150S型圓二色譜儀測定α毒素和PLC1-250蛋白的CD光譜，并記錄數(shù)據(jù)[14]。

1.8 PLC1-250蛋白生物學活性測定

將A型魏氏梭菌標準株C57-1的培養(yǎng)上清液和重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的菌體、菌體裂解物和上清液分別接種于卵黃瓊脂平板和血瓊脂平板，觀察是否具有磷脂酶C活性和溶血活性[15]。將100 μL含卵磷脂的卵黃稀釋液分別加入3只Eppendorf管，再分別加入100 μL生理鹽水、PLC1-250蛋白和α毒素進行混勻，37 ℃恒溫孵育24 h，通過觀察渾濁環(huán)出現(xiàn)與否來檢測是否具有磷脂酶C活性[16]。另取80只小鼠分為4組，每組20只，將A型魏氏梭菌標準株C57-1和5×109個重組菌株BL21(DE3) (pN -PLC1-250)經(jīng)口服或腹腔注射到小鼠體內(nèi)，觀察臨床癥狀并進行病理檢測[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pN-PLC1-250重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用PCR擴增技術(shù)，以pXETA02質(zhì)粒為模板，擴增出α毒素氨基端0.75 kb的PLC1-250基因，NcoⅠ和EcoRⅠ分別酶切PCR產(chǎn)物和pET-32a載體，連接后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，構(gòu)建含PLC1-250基因表達質(zhì)粒的重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)，提取重組質(zhì)粒pN-PLC1-250，并用限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ/EcoRⅠ進行酶切鑒定，結(jié)果證實重組質(zhì)粒pN-PLC1-250含有PLC1-250基因，核苷酸序列分析表明其基因序列和閱讀框架均正確(圖1)。

2.2PLC1-250基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)IPTG誘導4 h后取樣，進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，PLC1-250基因在BL21(DE3)宿主菌中得以表達，經(jīng)凝膠成像儀掃描分析，PLC1-250蛋白表達量占菌體總蛋白相對含量的18.76%(圖2)。

2.3 α毒素和PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用EXPASY服務(wù)器(http://www. expasy.org/ tools)上的SOPMA法預(yù)測α毒素和PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)(圖3)。α毒素蛋白中：α螺旋118個，占31.9%；β折疊78個，占21.1%；β轉(zhuǎn)角44個，占11.9%；無規(guī)則卷曲130個，占35.1%。PLC1-250蛋白中：α螺旋97個，占38.8%；β折疊42個，占16.8%；β轉(zhuǎn)角36個，占14.4%；無規(guī)則卷曲75個，占30.0%。預(yù)測結(jié)果表明，PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)與α毒素氨基端部分的二級結(jié)構(gòu)相比發(fā)生了一些變化，其二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，二者共占68.8%。

M，DL2000 DNA分子量標準；1，pN-PLC1-250+NcoⅠ/EcoRⅠM， DL2000 DNA marker; 1， pN-PLC1-250+NcoⅠ/EcoRⅠ圖1 重組質(zhì)粒pN-PLC1-250酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pN-PLC1-250 by enzyme digestion

M，低分子量蛋白標記；1，BL21(DE3)(pET-32a)全菌體；2，BL21(DE3)(pN-PLC1-250)全菌體；3，BL21(DE3)(pN-PLC1-250)包涵體M， Low molecular protein marker; 1， Total cell lysate of BL21(DE3)(pET-32a); 2， Total cell lysate of BL21(DE3)(pN-PLC1-250); 3， The inclusion bodies of BL21(DE3)(pN-PLC1-250)圖2 PLC1-250基因表達產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products of recombinant strain BL21(DE3)(pN-PLC1-250)

2.4 α毒素和PLC1-250蛋白分子的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測

以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)提供的α毒素的三維結(jié)晶結(jié)構(gòu)(3D)作為模板，利用EXPASY服務(wù)器(http:// www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)對α毒素和PLC1-250蛋白3D結(jié)構(gòu)進行同源模型構(gòu)建，并用Rasmol軟件繪制其3D結(jié)構(gòu)圖。結(jié)果顯示，α毒素蛋白共有9段α螺旋和8段β折疊，PLC1-250蛋白3D結(jié)構(gòu)也包括9段α螺旋，與α毒素蛋白氨基端部分的3D結(jié)構(gòu)相類似(圖4)。

2.5 α毒素和PLC1-250蛋白分子的圓二色譜分析

借助圓二色譜儀測定α毒素和PLC1-250蛋白分子的CD光譜(圖5、表1)，結(jié)果顯示，二者的CD光譜相類似。

h，α螺旋； e，β折疊； t，β轉(zhuǎn)角； c，無規(guī)則卷曲h， alpha helix; e， beta extended strand; t， beta turn; c， random coil圖3 α毒素和PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及比較Fig.3 Prediction and comparison of the second structure of α-toxin and PLC1-250 protein

2.6 重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)生物學活性測定

A型魏氏梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清液和重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培養(yǎng)上清液及菌體培養(yǎng)物在卵黃瓊脂平板上均出現(xiàn)了特征性渾濁環(huán)，而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌體裂解物并沒有出現(xiàn)特征性渾濁環(huán)，這說明PLC1-250是以分泌形式表達的，并且能分解卵黃瓊脂平板中的卵磷脂。磷脂酶C活性檢測結(jié)果顯示(圖6)：出現(xiàn)渾濁環(huán)的1號和2號管均能分解卵黃中的卵磷脂。上述結(jié)果表明，PLC1-250蛋白與α毒素一樣具有磷脂酶C活性。

在血瓊脂平板上，A型魏氏梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清出現(xiàn)了溶血環(huán)，而重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培養(yǎng)上清液、菌體培養(yǎng)物及菌體裂解物均沒出現(xiàn)溶血環(huán)，表明PLC1-250表達產(chǎn)物不具備α毒素的溶血活性。口服和腹腔注射重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的小鼠(試驗組)，觀察3周后沒有出現(xiàn)臨床癥狀，且剖檢后組織學檢查顯示，無病理變化(圖7)，表明重組菌株BL21(DE3) (pN-PLC1-250)已經(jīng)沒有致病性，而對照組(A型魏氏梭菌標準株C57-1)則出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，且剖檢后組織學檢查顯示，發(fā)生病理變化(圖8)。

圖4 α 毒素(A)和PLC1-250蛋白(B)分子3D結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the three-dimensional structure (3D) of α-toxin (A) and PLC1-250 protein(B)

圖5 α毒素(A)和PLC1-250蛋白分子(B)的圓二色譜圖Fig.5 Circular dichroism (CD) spectrum of α-toxin (A) and PLC1-250 protein (B)

表1 圓二色譜測定的α毒素和PLC1-250蛋白分子二級結(jié)構(gòu)成分比較

Table 1 Comparison of secondary structure elements of α-toxin and PLC1-250 protein based on circular dichroism spectrum

成分Elementα毒素α-toxin氨基配數(shù)量Quantityofaminoacids所占比例Proportion/%α毒素氨基端PLC1-250蛋白PLC1-250ofα-toxinamino-termi-nal氨基配數(shù)量Quantityofaminoacids所占比例Proportion/%α-螺旋Alphahelix12032.59839.2β-折疊Betaextendedstrand7620.53815.2β-轉(zhuǎn)角Betaturn4311.63815.2隨機卷曲Randomcoil13135.47630.4

1， α毒素； 2， PLC1-250蛋白； 3， 生理鹽水1， α-toxin; 2， PLC1-250 protein; 3， Physiological saline water圖6 α毒素和PLC1-250蛋白的磷脂酶C活性檢測Fig.6 Detection of phosphalipase C activity of α-toxin and PLC1-250

3 小結(jié)

本研究利用PCR擴增技術(shù)克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因，構(gòu)建起含PLC1-250基因表達質(zhì)粒的BL21(DE3)(pN-PLC1-250)重組菌株，經(jīng)序列分析和酶切鑒定，證實所構(gòu)建的pN-PLC1-250重組質(zhì)粒含有目的基因，且基因序列與閱讀框架均正確。利用SOPMA法預(yù)測PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)，同源模建其3D結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，三級結(jié)構(gòu)與α毒素相類似。對PLC1-250蛋白的生物學活性進行鑒定，結(jié)果顯示，重組菌株BL21(DE3)(pN-PLC1-250)的培養(yǎng)上清液及菌體培養(yǎng)物在卵黃瓊脂平板上均出現(xiàn)了特征性渾濁環(huán)，而BL21(DE3) (pN-PLC1-250)菌體裂解物并沒有出現(xiàn)特征性渾濁環(huán)，這說明PLC1-250是以分泌形式表達的，并且能分解卵黃瓊脂平板中的卵磷脂，即PLC1-250蛋白與α毒素一樣具有磷脂酶C活性。小鼠試驗結(jié)果表明，PLC1-250蛋白沒有溶血活性及致病性。這些工作為今后深入探索α毒素作用的分子機制，以及其分子結(jié)構(gòu)與生物學功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

A， 空腸； B， 肝臟； C， 肺臟； D， 心臟。圖8同A， Jejunum; B， Liver; C， Lung; D， Heart. The same as in Fig. 8圖7 試驗組小鼠組織學檢查結(jié)果Fig.7 Histological examination results of mice in the experimental group

圖8 對照組小鼠組織學檢查結(jié)果Fig.8 Histological examination results of mice in the control group

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(責任編輯 高 峻)

Structural analysis and identification of biological activity of alpha-toxin amino-terminal PLC fromClostridiumwelchiitype A

XU Chongli1， XU Chongbo2，*， GONG Yuchen3

(1.CollegeofBiologyandFoodEngineering，JilinInstituteofChemicalTechnology，Jilin132022，China; 2.NorthGuangdongCollaborativeInnovationandDevelopmentCenterforSwineFarmingandDiseaseControl，YingdongCollegeofLifeSciences，ShaoguanUniversity，Shaoguan512005，China; 3.CollegeofAnimalScience，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Amino-terminalPLC1-250 gene ofClostridiumwelchiiα-toxin was amplified by PCR. The recombinant strain BL21 (DE3)(pN-PLC1-250) containingPLC1-250 gene was constructed. It was shown that the recombinant plasmid pN-PLC1-250 containedPLC1-250 gene with correct sequence and ORF by identification of endonuclease-digesting and sequence analysis. SDS-PAGE analysis showed that the expression level of PLC1-250 proteins were about 18.76% of total cellular proteins. The secondary structure and three-dimensional structure of PLC1-250 proteins were predicted by SOPMA method on EXPASY website. The results showed that the secondary structure of PLC1-250 protein was composed of alpha helices and random coils. The three-dimensional structure of PLC1-250 protein was similar with amino-terminal domain of α-toxin protein. The study of biological activity laid foundation for further research of the molecular mechanism of α-toxin and the relation of its molecular structure and biological function.

Clostridiumwelchiitype A; alpha-toxinPLC-gene; biological activity; circular dichroism spectra

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.06

2016-09-26

吉林省教育廳“十三五”科學研究規(guī)劃項目(2016138)

許崇利(1974—)，男，黑龍江雞東人，博士，教授，研究方向為微生物分子生物學。E-mail: xcl902@163.com

*通信作者，許崇波，E-mail: xcb902@163.com

S852；Q78

A

1004-1524(2017)02-0213-07