草莓FabHLH3基因克隆表達分析與過量和干涉表達載體的構建

張 青，苗立祥，張豫超，楊肖芳，蔣桂華，*

(1.臨安市農林技術推廣中心，浙江 臨安 311300； 2.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

草莓FabHLH3基因克隆表達分析與過量和干涉表達載體的構建

張 青1，苗立祥2，張豫超2，楊肖芳2，蔣桂華2，*

(1.臨安市農林技術推廣中心，浙江 臨安 311300； 2.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

以八倍體草莓品種越心(Fragaria×ananassacv. Yuexin)為試材，利用RT-PCR技術從果實中克隆出FabHLH3基因全長編碼序列，運用生物學軟件對該序列進行相關生物信息學分析，同時采用實時熒光定量PCR方法對FabHLH3基因在不同組織、果實不同發育階段及不同光質處理下的表達模式進行研究。測序和分析結果表明，FabHLH3基因的CDS全長2 094 bp，編碼697個氨基酸殘基，該蛋白質理論分子量約為77.43 ku、等電點(pI)為6.05；經DNAMAN分析，核苷酸序列和氨基酸序列與二倍體森林草莓(F.vesca)FvbHLH3基因的一致性分別為92.04%和90.87%。利用實時熒光定量PCR檢測FabHLH3基因在葉、葉柄、花和果實中的表達情況，發現在葉中的表達量最高，隨著果實發育，FabHLH3基因表達量逐漸增加，在半紅期達到最高，紅果期開始下降。此外，FabHLH3基因的表達還受到紅光和藍光的誘導。用無縫克隆技術構建了FabHLH3基因的過量表達載體pGreen-FabHLH3和干涉表達載體pGreen-FabHLH3i，為進一步驗證FabHLH3基因的功能奠定了基礎。

草莓；FabHLH3；基因克隆；表達模式；過表達和干涉表達載體

色澤是構成外觀品質的重要指標，對鮮食果品及其加工具有重要的影響。色澤的形成主要由色素的種類和含量決定。植物中的色素主要有葉綠素、類胡蘿卜素、花色素和甜菜素等4類。草莓是一種色、香、味倶佳的水果，在果實成熟過程中最明顯的特征就是色澤的變化。已有研究表明，草莓成熟果實中最主要的色素是花青素，其中最主要成分是天竺葵素-3-O-葡萄苷[1]。

花青素是由類黃酮途徑一個特異分支合成的，它的代謝可以分為上游的苯丙烷類代謝途徑和下游的類黃酮代謝途徑。花青素合成代謝途徑各基因的表達豐度和調控機制直接影響色素的含量和組成。近年來的研究表明，轉錄因子在調控花青素代謝中也起著重要作用，特別是由MYB、bHLH和WD40組成的MBW三元復合體[2]。根據擬南芥MBW復合體(AtTT2、AtTT8和AtTTG1)的組成情況，Schaart等[3]利用酵母雙雜交技術預測了草莓中的MBW復合體由FaMYB9/FaMYB11、FabHLH3和FaTTG1組成。

為了進一步探明FabHLH3在草莓中的表達特點，本試驗以越心草莓果實cDNA為模板擴增bHLH3基因的全長，分析其在不同組織器官和果實發育期及不同光質條件下的表達特性；并將其全長CDS整合到植物表達載體上，構建出栽培草莓bHLH3基因的過量表達載體，同時選取CDS上的部分片段構建了干涉表達載體，從而為進一步驗證草莓bHLH3基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

八倍體草莓越心植株在浙江省農業科學院海寧楊渡創新基地栽培；分別采取葉片、葉柄、花、小綠果、白果、半紅果及紅果，取樣后立即在液氮中速凍并貯存于-70 ℃中；用紅、黃、藍、綠、白膜對草莓果實進行光質處理，在紅果期進行取樣。

反轉錄試劑盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)、克隆載體(pEASY-Blunt Zero Cloning Kit)、克隆感受態細胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell)、SYBR Green Ⅰ熒光定量試劑盒(TransStart Tip Green qPCR SuperMix)購自全式金公司；高保真DNA聚合酶(I-5TM2× High-Fidelity Master Mix)購自北京擎科新業生物技術有限公司；In-Fusion HD Cloning Plus購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒(SanPrep Spin Column & Collection Tube)和熒光定量用吸頭購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑為國藥藥品；引物合成及克隆產物測序均委托北京擎科新業生物技術有限公司進行；熒光定量PCR板和膜購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.2 草莓總RNA的提取及總cDNA的合成

采用CTAB法從草莓各組織中提取總RNA；用反轉錄試劑盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)進行DNA去除和cDNA合成，所得cDNA在-20 ℃保存備用。

1.3 基因全長擴增

50 μL PCR體系中，包括cDNA 1 μL，I-5TM2×High Fidelity Master Mix 25 μL，特異性上下游引物(10 μmol·L-1) Fa-b HLH3-Ford：5′- ATGGCGACACCGCCACCGAG -3′和 Fa-b-HLH3-Rev：5′- TTAAGAGTCAGACTGGGGTATGAC -3′各2 μL，用ddH2O補足至50 μL。反應程序為：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環；72 ℃終延伸 5 min，4 ℃終止反應并保存。

1.4 序列分析和結構預測

PCR產物經由1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收大小正確的片段，直接連接在克隆載體上，轉化大腸埃希菌感受態并涂布于LB+Amp固體培養基平板上。37 ℃隔夜培養后，挑取形狀規則的白斑，于LB+Amp液體培養基中培養并做菌落PCR，體系和程序同上，將擴增出大小正確條帶的菌落送測。

利用NCBI Blastn/p、DNAMAN、ClustalX、MEGA5.0等生物軟件進行氨基酸同源性比對，蛋白質分子量、等電點預測，以及基于氨基酸序列的系統進化樹的構建。

1.5 基因表達驗證

利用熒光定量PCR來檢測FabHLH3基因在不同器官組織及處理中的表達水平，定量PCR儀為羅氏公司的LightCycler?96，FabHLH3基因熒光定量檢測引物為FabHLH3-qFord：5′-GTAGTAGCAGACTCCGTGGTAT-3′和FabHLH3-qRev: 5′-GCACTGTCTTCCTCGTTTTGA-3′；內參基因actin的檢測引物為actin-Ford: 5′-AGCGTGGTTACTCATTTAC-3′和actin-Rev: 5′-CATCAGGCAACTCATAGC-3′；試驗體系包含2×transStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，cDNA 0.1 μL，正反引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，用ddH2O補齊至20 μL；反應程序為94 ℃ 30 s；然后94 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，45個循環；融解曲線為 95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；用GraphPad Prism 6進行數據處理和作圖。

1.6FabHLH3基因過量表達載體和干涉載體的構建

利用NotⅠ和SpeⅠ快速內切酶酶切pGreenⅡ 62-SK質粒[4]，電泳回收獲得線性載體；設計包含線性載體末端重疊序列的引物(FabHLH3-35SFord: 5′-ACCGCGGTGGCGGCCGCATGGCGACACCGCCACCG-3′和FabHLH3-35Srev: 5′-CGGGGGATCCACTAGTTAAGAGTCAGACTGGGGT-3′)，用高保真酶I-5TM進行擴增，電泳回收獲得目的基因片段；選取FabHLH3基因CDS序列上356 bp序列構建干涉表達載體，用引物FabHLH3-RNAi-Sford(5′-ACCGCGGTGGCGGCCGCCTTTCTTCGTCGATCACCA -3′)和FabHLH3-RNAi-Srev (5′-CCTGACGACGCCTCCGGAGGCGTCGTCAGGGGA-3′)擴增干涉正向片段，用FabHLH3-RNAi-ASFord(5′-GGAGGCGTCGTCAGGGGA-3′)和FabHLH3-RNAi-ASRev(5′-CGGGGGATCCACTAGTCTTTCTTCGTCGATCACCA-3′)擴增干涉序列反向片段，電泳回收獲得目的片段；利用In-Fusion HD Cloning Plus試劑盒進行無縫克隆，構建過量表達載體pGreen-FabHLH3和干涉表達載體pGreen-FabHLH3i。轉化農桿菌感受態，挑選菌落，并進行菌落 PCR檢測、質粒的雙酶切及測序檢測。

2 結果與分析

2.1FabHLH3基因克隆與序列

本研究利用CTAB法從栽培草莓品種越心半紅期果實中提取出總RNA，再以總RNA為模板，利用RT-PCR技術擴增出與預期大小相符的條帶。將該條帶回收，連接于平端克隆載體后獲得重組載體。測序結果表明，擴增片段長度為2 094 bp，編碼697個氨基酸殘基的假定蛋白質。該蛋白質理論分子量約為77.43 ku、等電點(pI)為6.05；與二倍體森林草莓的FvbHLH3(gene27827-v1.0-hybrid)[5]基因的核苷酸序列的一致性為92.04%，氨基酸序列的一致性為90.87%(圖1、圖2)。因此，擴增獲得的基因為栽培草莓的bHLH3基因，我們將其命名為FabHLH3。用軟件DNAStar對FabHLH3蛋白進行結構預測，其二級結構如圖3所示。根據Chou-Fasman的經驗參數法，FabHLH3蛋白的α-螺旋結構有25個，β-折疊結構有19個，轉角結構有50個。氨基酸親水性分析顯示，FabHLH3蛋白的大多氨基酸都是親水區域，蛋白骨架區內含有較多的柔韌區域，且分布不均勻，表明該蛋白的柔韌性較好，推測該蛋白屬柔韌性較好的親水性蛋白。

2.2 FabHLH3氨基酸序列同源性比較和系統進化

對已報道的bHLH3轉錄因子及文獻來源的與FabHLH3功能相近的bHLH轉錄因子氨基酸序列，用MEGA 5.0軟件構建系統進化樹。圖4進化樹表明，草莓與薔薇科中蘋果屬、梨屬、李屬等聚為一類，說明他們的進化關系較近，推測草莓與這些植物在進化過程中，具有某些相似的生理特征和形態特征。

2.3FabHLH3基因在不同組織中的表達

圖1 FabHLH3與FvbHLH3核苷酸序列比對分析Fig.1 Alignment of FabHLH3 and FvbHLH3 using nucleotide sequence

草莓果實的發育要經歷幾個明顯的過程，從開花坐果到綠色幼果到白果，再到開始轉色的半紅期，最后轉紅進入成熟期。利用熒光定量PCR技術研究了FabHLH3在越心草莓不同器官和果實發育期中的表達特性(圖5)。結果顯示，FabHLH3在草莓各器官中都有表達，其中在葉片中的表達量最高，在葉柄和花中的表達量相對較低。在果實中的表達量也顯著低于葉片，隨著果實逐漸成熟，FabHLH3的表達量呈先上升后下降的趨勢，在果實半紅期表達量達到最高，紅果期開始下降。由此可見，FabHLH3與草莓果實著色存在著一定的相關性。

2.4FabHLH3基因在不同光質處理下的表達

利用紅、黃、藍、綠、黑和白膜處理草莓果實，研究了FabHLH3對不同光質的響應(圖6)。結果表明，紅和藍光能夠顯著提高FabHLH3的表達量，其他光質與對照(白光)無顯著差異。由此可見，FabHLH3能夠受紅光和藍光的影響從而影響草莓果實著色進程。

圖2 FabHLH3與FvbHLH3氨基酸序列比對分析Fig.2 Alignment of FabHLH3 and FvbHLH3 using amino acid sequence

圖3 FabHLH3二級結構預測Fig.3 Prediction of FabHLH3 protein structure

2.5FabHLH3基因過量表達載體和干涉載體的構建

利用NotⅠ和SpeⅠ快速內切酶酶切pGreenⅡ 62-SK質粒，電泳回收獲得線性載體；利用無縫克隆技術構建FabHLH3基因過量表達載體和干涉載體(圖7)。轉化農桿菌感受態，挑選陽性菌落，進行菌落 PCR驗證，對重組質粒pGreen-FabHLH3和pGreen-FabHLH3i進行酶切驗證，分別能切出2 000和700 bp左右片段，與預期大小一致(圖8)。對陽性質粒送測序公司進行測序，所測出序列與預期構建序列完全一致。結果表明，過量表達載體pGreen-FabHLH3和干涉表達載體pGreen-FabHLH3i構建成功。

圖4 FabHLH3與其他植物bHLH氨基酸推導序列系統進化樹Fig.4 Phylogentic tree of bHLH deductive sequence of FabHLH3 and other plant species

不同組織間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同The different lowercase letters in different tissues show the significance at the level of 0.05.The same as below圖5 FabHLH3在不同組織和成熟期草莓果實中的表達Fig.5 The expression of FabHLH3 in strawberry tissues and fruits at different maturity stages

圖6 不同光質條件下完全成熟果實中FabHLH3的表達Fig.6 The expression of FabHLH3 in strawberry fruits being grown under colored light-quality plastic film

圖7 無縫克隆構建FabHLH3基因過量表達載體和干涉表達載體Fig.7 Strategy for construction of overexpression and silencing vector of FabHLH3 by in-fusion

M: DNA marker；A: 酶切檢測干涉表達載體pGreen-FabHLH3i的構建；1、2：挑選的2個陽性質粒酶切電泳；B：酶切檢測過量表達載體pGreen-FabHLH3的構建；3、4：挑選的2個陽性質粒酶切電泳M: DNA marker; A: Analysis of pGreen-FabHLH3i vector by double digestion; 1， 2: Two products of recombinant with restriction enzyme sites; B: Analysis of pGreen-FabHLH3 vector by double digestion; 3， 4: Two products of recombinant with restriction enzyme sites圖8 干涉表達載體和過量表達載體的檢測Fig.8 Analysis of overexpression and silencing vector

3 討論

成熟草莓果實中的主要花青素成分是天竺葵素，其合成除了受代謝途徑的基因調控外，還受轉錄因子的影響。雖然草莓果實中存在著一個抑制花青素合成的轉錄因子MYB1[6]，但最主要的是受MYB10轉錄因子的正向調控[7]。已有研究表明，在離體和植株上抑制果實中MYB10基因的表達都能使草莓果實不變紅[8-9]。近年來越來越多的研究表明，花青素的合成是受MYB、bHLH和WD40組成的MBW三元復合體共同調控的[2，10]。擬南芥MBW復合體是AtTT2、AtTT8和AtTTG1組成的，Schaart等[3]利用酵母雙雜交技術預測了栽培草莓中的MBW復合體由FaMYB9/FaMYB11，FabHLH3和FaTTG1組成的，這個MBW三元復合體既沒有MYB10，也沒有抑制因子MYB1，這幾個基因的功能也沒有明確。

bHLH轉錄因子廣泛存在于動植物中，有著十分重要的轉錄調控作用。近年研究表明，bHLH家族的部分成員在植物花青素合成代謝中起著重要的調控作用[11-12]。本研究從越心草莓中分離克隆了FabHLH3基因，其核苷酸序列和氨基酸序列與野生二倍體森林草莓的FvbHLH3基因的一致性為92.04%和90.87%。在葉、葉柄、花和果實中都有表達，其中在葉中的表達量最高，隨著果實發育FabHLH3基因表達量逐漸增加，在半紅期達到最高，紅果期略有下降。與之不同的是，有研究發現FabHLH78在果實中特異表達，且隨著果實發育，表達量逐漸增加[12]。但當利用熒光定量PCR檢測基因表達量時發現，FabHLH3與FabHLH78基因的表達模式類似，但其表達量是FabHLH78基因的100倍左右。

光質能夠影響草莓果實中花青素的含量，也能影響產量和果實品質[13-15]，其調控機理主要是通過影響合成酶活性和結構合成及轉錄調控因子基因的表達來實現[9，14]。本研究發現，FabHLH3基因的表達還受到不同光質的誘導，其中紅光和藍光能顯著提高紅果期的表達量。然而，作為MBW三元復合體中的一員，FabHLH3基因是如何調控花青素合成代謝的，還需要進一步研究。因此，我們用無縫克隆技術構建了FabHLH3基因的過量表達載體pGreen-FabHLH3和干涉表達載體pGreen-FabHLH3i，為進一步驗證FabHLH3基因的功能奠定了基礎。

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(責任編輯 張 韻)

Cloning and expression analysis ofFabHLH3 gene from cultivated strawberry and construction of overexpression and silencing vector

ZHANG Qing1， MIAO Lixiang2， ZHANG Yuchao2， YANG Xiaofang2， JIANG Guihua2，*

(1.AgriculturalTechnologyExtensionCentreofLin’an，Lin’an311300，China; 2.InstituteofHorticulture，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

The full-length cDNA sequence ofFabHLH3 gene was cloned from strawberry (Fragaria×ananassacv. Yuexin) through homology cloning method. Then， bioinformatics and expression pattern ofFabHLH3 gene were analyzed by some softwares and real-time fluorescent quantitative PCR technique， respectively. Sequence analysis showed that the cDNA ofFabHLH3 was 2 094 bp， encoding 697 amino acids， while the estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 77.43 ku and 6.05. After DNAMAN analysis， it shared 92.04% and 90.87% identity with the nucleotide sequence and amino acid sequence ofbHLH3 gene from woodland strawberry(F.vesca)， respectively. The expression ofFabHLH3 was analyzed in leaf， petiole， flower and fruit being grown under colored light-quality plastic film. The results showed thatFabHLH3 was expressed in all the tissues and the highest level was found in leaf. The expression analysis showed that the expression level ofFabHLH3 was gradually increased during fruit development. The lowest expression was detected at small green fruit stage， and a reduced peak appeared at the full red stage. In addition， the expression ofFabHLH3 gene can be induced by red and blue light. The overexpression and silencing vectors ofFabHLH3， pGreen-FabHLH3 and pGreen-FabHLH3i， were constructed by in-fusion method with a plant expression vector pGreenII 62-SK. It would be used in functional analysis in the future research.

strawberry;FabHLH3; gene cloning; expression pattern; overexpression and silencing vector

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.07

2016-10-14

國家自然科學基金(31201613)；浙江省自然科學基金(LY16C150004)

張青(1962—)，男，浙江臨安人，高級農藝師，主要從事果樹栽培技術推廣。E-mail: zq373@163.com

*通信作者，蔣桂華，E-mail: jgh2004267@sina.com

S668.4

A

1004-1524(2017)02-0220-08