結核桿菌實驗室檢測技術與臨床應用進展

嚴芝光，周麗

（廣西壯族自治區防城港市第一人民醫院，廣西 防城港 538021）

綜述

結核桿菌實驗室檢測技術與臨床應用進展

嚴芝光，周麗

（廣西壯族自治區防城港市第一人民醫院，廣西 防城港 538021）

結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病。本文就結核桿菌實驗室檢測技術與其臨床實際應用做如下綜述。

肺結核；結核分枝桿菌；檢驗技術；診斷

結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，由結核分枝桿菌（MTB）感染而引起。據世界衛生組織（World Health Organization, WHO）統計我國是全世界22個結核病流行嚴重的國家之一[1]，患結核病人數居世界第2位。目前，結核病診斷手段歸納有以下3個方面：①實驗室診斷技術；②影像學診斷技術；③治療性診斷手段。結核分枝桿菌可以累及全身各個系統，造成了結核病的臨床表現多樣，尤其是肺外結核病變的診斷手段比較少，給臨床診斷帶來極大的困難，同時由于各種診斷方法的敏感性與特異性不高，導致結核病的控制更加復雜、困難。因此，在結核病實際防治工作當中，如何提高疾病的早期診治成為控制結核病發生的關鍵環節。隨著當前醫療水平的提高，實驗室檢測技術在結核病診治方面體現出重要作用。為此，本文就結核桿菌實驗室檢測技術與其臨床實際應用狀況進行如下綜述。

1 微生物學檢測技術及應用

1.1 涂片染色技術

1.1.1 萋尼氏抗酸染色法（Z-N-AFS） Z-N-AFS具體操作是利用抗酸染液對痰涂片進行染色處理，讓后將其置于普通光學顯微鏡下進行鏡檢，每張Z-N染色痰涂片閱片時間約為5 min。此方法具有多種優點，如操作簡便、價格低廉、檢測時間短、特異度高等，因此，是當前廣泛用于結核病實驗室檢查的一項常用的診斷技術，同時是WHO推薦使用的結核病診斷技術之一。該方法的缺陷是敏感性較低，且存在不能有效區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的缺點。國外有文獻[2]報道Z-N-AFS敏感性僅占0%-44%；王震等[3]報道Z-N-AFS敏感性為35.29%；文獻[4,5]報道Z-N-AFS敏感性為13.85%-22.90%。

1.1.2 免疫磁珠捕獲抗酸染色法（IMC-AFS） 取捕獲處理后的免疫磁珠加小牛血清混勻后進行AFS制片，染色干燥后鏡檢。王震等[5]報道IMC-AFS敏感性為43.14%，比Z-NAFS敏感性提高，特異性相似；楊江華[6]報道IMC-AFS將有助于提高痰菌陰性結核病的診斷效率。該方法同樣具有檢驗時間短、操作較簡單、價格低、特異度高等優點；缺陷與Z-N法相似。

1.1.3 熒光染色鏡檢法 其原理為：對抗酸桿菌進行熒光染色后，與菌體結合的染料可被特定波長的光線激發后產生熒光亮點，要求觀察50個視野，讀片時間為1 min-3 min。國外相關研究[7]指出，此方法在提高抗酸桿菌10%檢出率的同時能夠保持相似的特異度。隨著當前科學技術的發展，LED光源、熒光顯微鏡技術的發光二極管（LED）熒光顯微鏡應運而生，在2011年，衛生組織將其作為取代傳統熒光顯微鏡的技術，同時將其替代了以Z-N染色為基礎的傳統光學顯微鏡檢測法。與傳統的熒光顯微鏡相比，LED價格更低、使用壽命長，使用相對簡便。最近又發展了建立在熒光染色基礎上的全自動化讀片系統TBDx，通過將熒光染色后的涂片標本置于TBDx系統內，便會自動讀取數據、報告檢驗結果；該系統每張涂片的讀片分析時間為5 min-6 min，其診斷準確率與專業人員判斷結果無顯著差異[8]。

1.2 結核菌培養技術

1.2.1 改良羅氏培養法（L-J） 目前，結核分枝桿菌培養已被認證為結核分枝桿菌檢測、藥敏試驗的金標準。結核桿菌診斷的經典方法是改良羅氏培養法。李寧等[9]報道的L-J法培養陽性率是7.1%，體現出此方法的多種應用特點，如實驗費用低、有效保持細菌形態、可清晰地觀察菌落形成過程、便于對菌落施以菌型鑒定與耐藥性試驗等，然而由于耗時長（陰性報告需觀察8周）、敏感性不高等問題的存在，限制其實際應用。

1.2.2 結核桿菌快速培養法 多數結核桿菌快速培養技術是由美國BD公司生產的Bactec MGIT960TB檢測系統，此系統是一款全自動分枝桿菌培養儀，具備快速培養、檢測及藥敏技術，作用原理如下：采用分枝桿菌生長指示管法（MGIT），即在Middebrook7H9液體培養管中包埋有對氧濃度變化高度敏感的熒光顯示劑，以測定氧濃度變化為依據，對分支桿菌生長狀態進行檢測；一旦氧分子被消耗，便會出現培養基氧化還原電勢呈降低趨勢，而顯示劑則出現熒光，提示結果呈陽性。該技術敏感度高、檢測速度快，1周-3周即可檢測到分枝桿菌的生長。王馨[10]報道的陽性率為70.05%，Katila等[11]報道的陽性率為82.5%-94%。由此可知，此方法具有檢測時間短、檢出率高、特異性強等特點，但儀器、試劑昂貴，不易在基層診治單位推廣。

2 免疫血清學檢測技術及應用

2.1 斑點免疫膠體金法（DIFA） 其作用原理如下：通過把分離純化的MTB特異性外膜蛋白/LAM點樣，加以固化在硝酸纖維膜載體上，對人血清內MTB IgG抗體進行捕獲，并使用葡萄球菌A蛋白（SPA）膠體金綴合物進行標記，反應時間15 min。王震等[3]報道該法特異性為70.00%，敏感性為60.78%；王志佳等[12]報道該法特異性為80.9%，敏感性為73.9%。DIFA法具有結果快速、可靠、操作簡單、不需進行鏡下觀察，適用于普通人群普查快速檢測和流行病學的調查。

2.2 免疫色譜法 免疫色譜法在臨床上應用十分廣泛，該法與膠體金法的檢測方法基本一致，即非結核分枝桿菌不能分泌MPB64蛋白，但結核分枝桿菌可以有效分泌MPB64蛋白，進而達到鑒別區分目的[13]。衛生組織提出，在臨床實際工作中可以通過結合免疫色譜法、液體培養鑒定分枝桿菌展開菌群，在成功分離培養結合分枝桿菌的同時也可以及時滿足藥敏試驗實際需求[14]。王軍喜[15]報道，對結核分枝桿菌復合群進行免疫色普法檢測，經統計分析可知靈敏度、特異度、陽性預期值、陰性預期值分別是98.5%、100.0%、100.0%、97.7%；免疫色譜法比膠體金法的臨床優越性更為顯著，但是檢測成本比膠體金法本高。

2.3 酶聯免疫吸附法（ELISA） 多采用間接法。原理為：經結核桿菌純化蛋白衍生物（PPD）或細胞壁成分阿拉伯甘露聚糖脂（LAM）或重組的特異性蛋白質抗原包被聚苯乙烯微孔板，與待檢血清及酶標抗人IgG抗體形成抗原抗體復合物，呈色反應與抗結核桿菌抗體的水平成正比。國內資料[16]報道該法敏感性為88.5%，特異性為97.3%。目前，ELISA法檢測已成為臨床用于檢測結核桿菌感染的重要免疫血清學檢測方法之一，在結核病診斷、應用等方面得到普遍應用。

2.4 干擾素體外釋放酶聯免疫法 作用原理如下：通過將致病性結核分枝桿菌特有的RD1區編碼早期分泌靶向抗原6-kd（ESAT-6）、培養濾過蛋白10（CFP10）肽段庫作為抗原，對全血標本內結核抗原特異性T細胞起到刺激作用，促進免疫應答的產生，干擾素的分泌，然后利用酶聯免疫反應檢測結核特異性效應T細胞，從而判斷待檢者是否感染結核分枝桿菌及感應程度的方法。該方法以英國Oxford公司生產的T-SPOT.TB試劑盒及北京萬泰公司生產的TBIGRA試劑盒為代表。TB-IGRA和T-SPOT.TB檢測方法在靈敏度和特異度差異上無統計學意義[17]。其臨床應用價值在于：①對肺內、肺外結核患者具備較高的陽性率和特異性。鐘靖等[18]報道γ-干擾素釋放試驗對肺外結核的靈敏度為92.0%，特異性為94.0%；臨床局限性在于：①干擾素釋放試驗檢測費用相對較高，不適用經濟不發達、貧困等地區的應用；②干擾素釋放試驗難以對結核病的發生、發展等狀況作出良好的預測評估，加之臨床數據原因，就≤5個患者而言，難以提供更加精確的評價指標[19]。

3 分子生物學檢測技術及應用

3.1 Xpert MTB/RIF技術 Xpert MTB/RIF試驗是美國Cepheid公司研發的分子檢測技術，其以全自動半巢式實時PCR技術為基礎、以rpoB基因耐藥決定區為靶基因，能夠在2 h內通過對分枝桿菌（MTB）、利福平（RIF）耐藥性進行檢測。新英格蘭雜志公布的研究結果表明以培養法為參考標準Xpert MTB/RIF的特異性為99.2%，敏感性為92.2%，2010年WHO首次推薦Xpert MTB/RIF技術的使用。由此可知，Xpert MTB/RIF技術在MTB、RIF耐藥性方面的特異性、敏感性均較高，充分體現出其操作簡便、監測結果精準等特點，值得在結核病診療機構中進行大力推廣、使用。

3.2 聚合酶鏈反應（PCR）技術 其原理如下：通過以人工合成的寡核苷酸片段為引物、以待擴增的DNA分子為模板，促使目的片段經DNA聚合酶作用進行延伸，直至完成新DNA的合成。常用的有普通PCR技術、聚合酶鏈反應熒光探針技術和免疫磁珠捕獲聚合酶鏈反應技術（IMCPCR-ELIST）等。陸云鷗等報道[20]PCR熒光探針法的的陽性率與BD960液體培養法差異無統計學意義，僅需1 d就可以得到結果。可見，PCR技術的應用效果理想，一方面可以保持檢測快速簡便，另一方面能夠提高檢測陽性率，便于結核病患者得到早期診治，尤其是抗酸染色陰性的活動性結核病患者。

3.3 重組酶聚合酶等溫擴增技術（RPA） RPA是一種新型的恒溫擴增技術，可以有效彌補PCR反應過程精準熱循環的缺陷，即僅在恒溫環境下便可成功實現核酸分子擴增反應，RPA反應速度較快，一般從開始到完成只需5 min-15 min，而擴增產物可通過實時熒光、瓊脂糖電泳或金標記免疫反應等方法檢測。體現出RPA技術操作簡便、快速靈敏度高等特點，適合于床旁快速檢測，有利于在基層單位或邊遠山區推廣。

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