單向灌流法評價復方龍脈寧湯劑配伍對葛根素腸吸收的影響

柏希慧+劉詩雨+王晶+王昌利+宋逍

[摘要]建立大鼠在體單向腸灌流模型，采用高效液相色譜法測定灌流液中葛根素的濃度，考察葛根、葛根穿山龍、葛根川芎和復方龍脈寧4種湯劑在十二指腸、空腸、回腸和結腸中葛根素的吸收情況。結果顯示在十二指腸和回腸中，葛根穿山龍組與復方龍脈寧組葛根素的吸收參數無顯著性差異，但均顯著高于葛根和葛根川芎組的吸收（P<005）；在空腸和結腸中，3個配伍組中葛根素的吸收參數與葛根單藥組相比，存在顯著性差異（P<005），而復方龍脈寧組中葛根素的吸收參數與葛根穿山龍和葛根川芎組相比也存在顯著性差異（P<005）。表明在大鼠全腸段中，復方龍脈寧湯劑對葛根素的吸收有明顯的促進作用。在十二指腸和回腸中，復方中穿山龍對葛根素的吸收有明顯的促進作用；在空腸和結腸中，穿山龍和川芎能協同促進葛根素的吸收。

[關鍵詞]葛根素； 復方龍脈寧； 配伍； 單向灌流模型； 重量法Effect of compound

中藥無論是單味藥還是復方，均含有眾多的化學成分，多成分是中藥制劑臨床使用的基本特征，但是單味藥在臨床應用中往往存在活性成分生物利用度低、吸收差的問題，而復方配伍后藥物之間會發生某些相互作用并產生不同的效用，能夠改善有效成分的生物利用度[13]。

復方龍脈寧方（FFLMN）由葛根、穿山龍、川芎、蜂膠4味中藥組成，具有通絡活血、化瘀解毒的功效，臨床上主要用于治療中風所致的半身不遂、肢體麻木、口眼歪斜和胸痹所致的胸悶氣短、心悸、失眠等癥[4]。葛根為全方君藥，其主要有效成分葛根素具有擴張冠狀動脈及腦血管、改善心肌代謝、改善腦部微循環、抗心律失常、降低血壓、抑制腫瘤細胞生長等作用[45]。但是葛根素水溶性較差，口服后難以被吸收，絕對生物利用度只有375%左右[5]。因此本試驗采用大鼠在體單向灌流模型，考察葛根、葛根穿山龍、葛根川芎和復方龍脈寧4種湯劑在十二指腸、空腸、回腸和結腸中對葛根素吸收的影響，探討中藥復方用藥與單味用藥的吸收差異，說明中醫復方配伍用藥的科學性。

1材料

UltiMate3000液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；BT1001F型蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；AR1140電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；HH2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；X1型高速離心機（Gene Company Limited）。

蜂膠，陜西省咸陽市自然之子蜂產品公司，經陜西中醫藥大學藥學院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為正品蜂膠；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%，批號110752201514）；烏來糖（上海山浦化工有限公司）；氯化鈉注射液（辰欣藥業股份有限公司）；乙腈（色譜純，Thermo Fisher Scientific）；水為超純水；其余試劑均為分析純。葛根飲片，寶雞向源中藥飲片有限責任公司，批號20160301，經陜西中醫藥大學藥學院生藥教研室王繼濤教授鑒定為豆科植物野葛的干燥根莖；穿山龍飲片、川芎飲片（西安盛興中藥飲片公司，批號20160301）。

SD雄性大鼠，體重（250±20） g，由西安交通大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（陜）2012003。適應性飼養1周，實驗前禁食12 h，自由飲水。

2方法與結果

21湯劑的制備

211復方龍脈寧湯劑取葛根6 g，穿山龍4 g，川芎4 g，蜂膠2 g，分別加14倍量純凈水浸泡60 min。葛根先煎30 min，蜂膠除蠟[6]，而后將4味藥合并煎煮（先武后文）2次，第1次30 min，第2次20 min，合并煎煮濾液，濃縮至50 mL，即得復方龍脈寧湯劑（FFLMN）儲備液。

212方藥不同配伍湯劑A：葛根6 g；B：葛根6 g穿山龍4 g；C：葛根6 g川芎4 g。分別按與FFLMN相同煎煮方法制備，即得葛根湯劑（GG）、葛根穿山龍湯劑（GGCSL）、葛根川芎湯劑（GGCX）儲備液。

213湯劑中葛根素含量測定FFLMN及其不同配伍湯劑中葛根素的含量按照文獻[7]條件測定。結果表明葛根、葛根穿山龍、葛根川芎和復方龍脈寧4種湯劑中葛根素的質量濃度分別為30，21，24，28 g·L-1。

22溶液的配制

221Krebsringer試液（KR緩沖液）[8]稱取NaCl 78 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g，加蒸餾水定容至1 L，即得。

222葛根素對照品的配制精密稱取葛根素對照品75 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制成質量濃度為300 mg·L-1的葛根素對照品儲備液。

223腸灌流液的配制分別移取GG，GGCSL，GGCX，FFLMN湯劑儲備液適量于100 mL量瓶中，KR液稀釋定容至刻度，得葛根素質量濃度約為50 mg·L-1的GG，GGCSL，GGCX，FFLMN腸灌流液。

23分析方法的建立

231色譜條件[7]BDS HYPERSIL C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈01%磷酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長203 nm；流速10 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

242數據分析本試驗采用重量法對供試液流入和流出的體積進行校正，并計算藥物吸收常數（Ka）和表觀吸收常數（Papp）。

Ka=1-ρoutρin×VoutVin×Qπr2l

Papp=-Qlnρoutρin×VoutVin2πrl

其中，Vin和Vout分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積（mL）（假定灌流液和收集液的密度相同），l和r分別為灌流腸段的長度（cm）和橫截面半徑（cm），Q為灌流速度（mL·min-1），ρin和ρout分別為灌流液和收集液的質量濃度（mg·L-1）。

243統計學分析采用SPSS190軟件對數據進行單因素方差分析（ANOVA），當 P<005時判定具有顯著差異，結果以±s表示，組間差異的比較采用t檢驗。

244不同配伍組中葛根素在十二指腸中的吸收取葛根素質量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項下方法操作，計算各配伍組中葛根素在十二指腸的吸收參數，結果見表3，4。在十二指腸中，葛根穿山龍組與復方龍脈寧組中葛根素的吸收參數無顯著性差異，但與葛根組和葛根川芎組比較均有顯著性差異（P<005）。表明復方中穿山龍對葛根素的吸收起主要促進作用。

245不同配伍組中葛根素在空腸中的吸收取葛根素質量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項下方法操作，計算各配伍組中葛根素在空腸的吸收參數，結果見表3，4。在空腸中，葛根穿山龍、葛根川芎及復方組中葛根素的吸收均高于葛根組，統計學分析表明其具有顯著性差異（P<005）；而復方組與葛根穿山龍、葛根川芎組比較，葛根素的吸收也存在顯著性差異（P<005）。結果表明復方中穿山龍、川芎對葛根素的吸收起協同促進作用。

246不同配伍組中葛根素在回腸中的吸收取葛根素質量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項下方法操作，計算各配伍組中葛根素在回腸的吸收參數，結果見表3，4。在回腸中，葛根穿山龍組與復方龍脈寧組中葛根素的吸收參數無顯著性差異，但較葛根組與葛根川芎組均有顯著性差異（P<005）。結果表明復方中穿山龍對葛根素的吸收起主要促進作用。

247不同配伍組中葛根素在結腸中的吸收取葛根素質量濃度約為50 mg·L-1的不同配伍組腸灌流液，按241項下方法操作，計算各配伍組中葛根素在結腸的吸收參數，結果見表3，4。在結腸中，葛根穿山龍、葛根川芎及復方組中葛根素的吸收均高于葛根組，統計學分析表明其具有顯著性差異（P<005）；而復方組與葛根穿山龍、葛根川芎組比較，葛根素的吸收也存在顯著性差異（P<005）。結果表明復方中穿山龍、川芎對葛根素的吸收起協同促進作用。

3討論

研究藥物吸收的方法主要有在體法、離體法和體內法。相比于后2種方法，在體法因不切斷血管和神經系統，提高了腸段的生物活性，因此被廣泛應用到藥物吸收的研究中[13]。在體腸道單向灌流常用的體積校正方法有：酚紅法和重量法。重量法因其真實地反映了腸道水分吸收情況而突顯出一定的優勢[14]。因此，本實驗采用在體法研究復方湯劑配伍對君藥葛根中葛根素腸吸收的影響，并利用重量法對灌流前后體積進行校正。

中藥配伍有減毒增效作用，目前研究主要集中在中藥配伍改善活性成分的藥理效應上[1516]，而本文從吸收的角度研究中藥配伍后對活性成分的影響效果。結果顯示在大鼠全腸段中，復方龍脈寧湯劑對葛根中葛根素的吸收有明顯的促進效果。通過進一步研究發現，在十二指腸和回腸中，復方中穿山龍對葛根素的吸收起到了明顯的促進作用；而在空腸和結腸中，復方中穿山龍和川芎對葛根素的吸收起到了協同促進作用。這在一定程度上體現了復方龍脈寧配伍的科學性，同時也說明了中藥復方配伍用藥的意義之所在。

但是本文略顯不足之處是并未對穿山龍、川芎促進葛根素吸收的機制進行相關研究，因此后續研究中可針對此方面進行相關研究探討。

[參考文獻]

[1]劉洋，王剛，董玲，等 中藥生物藥劑學分類系統中多成分環境對葛根素滲透性的影響[J] 中國中藥雜志，2014，39 （23）：4505

[2]陳益杭，李孟璇，孟兆青，等 藥對研究（Ⅲ）葛根人參藥對對大鼠腸吸收的影響[J]中國中藥雜志，2015，40 （15）：3094

[3]郭震浪，蘇振寧，戴韻峰，等葛根芩連湯治療小兒輪狀病毒性腸炎療效的Meta分析[J]中國實驗方劑學雜志，2015，21（24）：199

[4]董林娟，張文娟，劉詩雨，等 龍脈寧方中葛根素在心肌缺血大鼠體內藥動學藥效學相關性研究[J] 中國中藥雜志，2016，41（8）：1535

[5]黃嗣航，龍曉英，袁飛，等 酚紅法和改良重量法分別研究葛根素的大鼠在體腸吸收機制[J] 廣東藥學學報，2012，28 （6）：603

[6]馬海芳，王昌利，史亞軍 蜂膠除蠟工藝研究[J] 中南藥學，2014，12 （5）：448

[7]王莎，王昌利，史亞軍 復方龍脈寧HPLC指紋圖譜的研究[J] 中華中醫學刊，2015，33 （1）：89

[8]陳新民，李俊松，李文，等 五味子有效成分的大鼠在體單向灌流腸吸收[J] 藥學學報，2010，45 （5）：652

[9]Sun M H， Zhai X Z， Xue K W， et al Intestinal absorption and intestinal lymphatic transport of sirolimus from selfmicroemulsifying drug delivery systems assessed using the singlepass intestinal perfusion（SPIP） technique and a chylomicron flow blocking approach：linear correlation with oral bioavailabilities in rats[J].Eur J Pharm Sci， 2011， 43（3）：132

[10]Zuo Z， Zhang L， Zhou L M， et al Intestinal absorption of hawthorn flavonoids——in vitro， in situ and in vivo correlations[J] Life Sci， 2006， 79 （26）：2455.

[11]饒小勇，龔明，尹珊，等 白頭翁皂苷D在大鼠腸道的吸收行為研究[J] 中草藥，2013，44（24）：3515

[12]王進榮，王平，楊永茂，等 單向灌流法評價蘆薈大黃素大鼠體內腸吸收的研究[J] 中國中藥雜志，2011，36 （17）：2393

[13]鄧少東，張鵬，林勵，等 單向灌流法研究巴戟天低聚糖的大鼠腸吸收特性[J] 中國中藥雜志，2015，40 （1）：134

[14]劉詩雨，柏希慧，董林娟，等 基于單向灌流法的葛根素羧甲基殼聚糖微球腸吸收特性研究[J] 中草藥，2016，47 （14）：2488

[15]汪汀，馮芳 單向灌流法評價梔子厚樸湯方劑配伍對梔子苷腸吸收的影響[J] 藥學與臨床研究，2012，20 （3）：177

[16]李桓，周學平，陸艷基于代謝組學的中藥配伍減毒研究策略探討[J]中國實驗方劑學雜志，2015，21（8）：226[責任編輯曹陽陽]

劉群等：麝香保心丸中5種人參皂苷類化合物在心肌梗死大鼠血漿中的藥代動力學研究

[收稿日期]20160823

[基金項目]國家自然科學基金項目（81473327）

[通信作者]*柳潤輝，教授，博士，主要從事天然產物活性成分和中藥復方藥效物質基礎及作用機制研究，Tel：（021）81871245，Email：lyliurh@126com