超高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品保鮮劑中4-己基間苯二酚的含量

高學(xué)慧，郝云彬，張小軍，梅光明，陳 思，嚴(yán)忠雍，李佩佩，常家琪,4，韓程程,4

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；4.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

近年來，食品安全問題越來越多，由于水產(chǎn)品儲(chǔ)藏期較短，水產(chǎn)品保鮮劑的廣泛應(yīng)用備受人們的關(guān)注。4-己基間苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）為白色、黃白色針狀結(jié)晶，分子式為C12H18O2，分子量為194.27，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，近年來作為一種新型的抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于各種食品的保鮮過程中。1991年MCEVILY[1]首先提出4-HR在防止蝦類黑斑形成以及氧化黑變中應(yīng)用，作為蝦中酚氧化酶的有效抑制劑，楊峰等[2]研究了4-HR能夠有效的抑制南極磷蝦脂肪的氧化，對(duì)其品質(zhì)變化影響顯著。隨后研究發(fā)現(xiàn)，4-HR可對(duì)蘋果、杏鮑菇、雞腿菇[3]等原料產(chǎn)生同樣的抑制褐變的效果。周會(huì)玲等[4]采用不同濃度4-HR處理紅富士蘋果，結(jié)果表明4-HR能有效的抑制鮮切蘋果的褐變，提高貯藏品質(zhì)。王毓[5]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鮮切杏鮑菇中4-HR的含量，表明4-HR對(duì)果蔬具有良好的抗褐變效果，是亞硫酸鹽、抗壞血酸等良好的替代品，也可為杏鮑菇保鮮貯藏以及食品安全質(zhì)量監(jiān)督提供技術(shù)理論。根據(jù)我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2014）規(guī)定：鮮水產(chǎn)（僅限蝦類）最大使用量可按生產(chǎn)需要適量使用，最大殘留量≤1 mg/kg。由于水產(chǎn)品水分含量高，其儲(chǔ)藏期較短，易引起腐敗、褐變等現(xiàn)象，使用食品添加劑可以有效的改善水產(chǎn)品的外觀及品質(zhì)，4-HR作為水產(chǎn)品保鮮劑的成分之一，在水產(chǎn)品保鮮過程中得到了廣泛的使用。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)4-HR的方法最主要有氣相色譜法、高效液相色譜-熒光法[6-8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]和氣相色譜-質(zhì)譜法[10]。高效液相色譜-熒光法作為一種靈敏度高、快速準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)技術(shù)，已廣泛應(yīng)用到對(duì)蝦蟹類等水產(chǎn)品中4-HR殘留量的測(cè)定。但是對(duì)于保鮮劑中4-HR的含量測(cè)定，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜法對(duì)保鮮劑中4-HR含量進(jìn)行分析，用于檢測(cè)保鮮劑產(chǎn)品的質(zhì)量以及保鮮劑劑在添加過程中的使用量，同時(shí)，可判斷市售標(biāo)識(shí)含有4-HR的水產(chǎn)品保鮮劑的真?zhèn)?，?duì)4-HR在蝦類保鮮劑研究領(lǐng)域應(yīng)用提供依據(jù)。

圖1 4-己基間苯二酚的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 4-hexylresorcinol

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）包括熒光檢測(cè)器（美國(guó)waters公司）；MS2漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）；Centrifuge 5810高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?？婆d儀器有限公司）；超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；AL204型電子天平（感量為0.1 mg）；SL-502N型臺(tái)式天平（感量為0.01 g）

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備高純水；乙酸乙酯均為色譜純（德國(guó)Merk公司）；無水乙酸銨（色譜純，美國(guó)Merk公司）；乙腈等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品（C12H18O2，純度為99%，中國(guó)Alfa Aesar公司）

4-HR標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取5.0 mg（精確至0.1 mg）的標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為100 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯藏于-18℃冰箱中密封保存，溶液有效期為1個(gè)月。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 nm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（7/3，V/V）；柱溫：35℃；樣品室溫度：10 ℃；激發(fā)波長(zhǎng)：280 nm；發(fā)射波長(zhǎng) 310 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3 樣品前處理

稱取0.1 g粉末（精確到0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈溶解，蓋塞，旋渦混勻1 min，超聲提取10 min，6 000 r/min離心5 min，取0.5 mL過濾液于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度。取1 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

4-己基間苯二酚是一種弱酸性物質(zhì)，微溶于水，易溶于極性有機(jī)溶劑。由于乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷等為正相溶劑，對(duì)儀器有一定的損害，且易揮發(fā)，在旋蒸的過程中可能有一定的損失，其提取效率較低。本實(shí)驗(yàn)選用乙醇、甲醇、乙腈三種有機(jī)試劑作為提取劑，對(duì)于甲醇和乙醇來說，提取的雜質(zhì)峰較多，對(duì)于4-HR峰的測(cè)定有干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。而乙腈提取效率高，雜質(zhì)較少，未見干擾峰，能滿足提取分析要求，結(jié)果見表1。綜上所述，本方法選擇乙腈作為提取溶劑。

表1 不同溶劑提取效果比較Tab.1 Comparison of extraction effect of different solvents

2.2 色譜條件優(yōu)化

比較分析了乙腈-水（70：30，a）、乙腈-水（60：40，b）、甲醇-水（70：30，c）和甲醇-水（60：40，d）作為流動(dòng)相時(shí)色譜圖基線、峰型、4-HR與雜質(zhì)干擾峰的分離效果，結(jié)果表明：當(dāng)乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)干擾峰較多，且不能和樣品中雜質(zhì)峰分離，因此選用水最為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑為乙腈時(shí)，色譜圖基線更平穩(wěn)，雜質(zhì)干擾峰較少，出峰時(shí)間適中，分離效果最佳，因此選用乙腈作為有機(jī)相。在反相液相色譜中，有機(jī)溶劑比例越大，目標(biāo)物保留時(shí)間越短；但為讓目標(biāo)峰與溶劑峰以及其它雜峰分離，實(shí)驗(yàn)最終選用乙腈-水（70：30）作為流動(dòng)相。不同溶液作為流動(dòng)相的洗脫色譜圖如圖2所示。

由于4-HR對(duì)熒光具有特異性，采用熒光檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行分析，熒光檢測(cè)器[11]靈敏度較高，且抗干擾能力比較強(qiáng)。數(shù)據(jù)率為5點(diǎn)/s時(shí)，4-HR峰均勻?qū)ΨQ，單峰采集點(diǎn)數(shù)充分，且基線也無密集雜亂等現(xiàn)象。段小娟等[12]采用高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定蝦中的4-HR，在5.0 min左右時(shí)出峰，本方法目標(biāo)物在2.0 min左右即出峰，可明顯縮短分析時(shí)間，具有檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。

圖 2 以乙腈-水（a）、乙腈-水（b）、甲醇-水（c）、甲醇-水（d）為流動(dòng)相洗脫色譜圖Fig.2 Chromatogram of 4-HR using acetonitrilewater （a）,acetonitrile-water （b）,methanol-water （c）and methanol-water（d）as mobile phase

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL以及20.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別進(jìn)樣5 μL，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖3）。線性方程為，R=0.999，表明4-HR的濃度與相應(yīng)峰面積在0.10～20.00 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。保鮮劑溶液中最低檢出濃度為5.0 μg/kg，保鮮劑粉劑的檢出限為2.0 mg/kg。

圖3 4-HR標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship of 4-HR standard working curves

2.4 方法的準(zhǔn)確性和精密度

按照前處理方法，對(duì)空白保鮮劑樣品中添加不同濃度的4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度分別為0.50 μg/mL、2.00 μg/mL和10 μg/mL，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次，結(jié)果見表2。研究發(fā)現(xiàn)方法回收率為83.75%～100.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.76%，該方法回收率和精密度可以滿足檢測(cè)的要求。

表2 加標(biāo)樣品的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 The average recoveries and RSD of the spiked samples

2.5 實(shí)際樣品分析

本研究利用建立的的4-HR檢測(cè)方法對(duì)市售蝦類保鮮劑樣品進(jìn)行了實(shí)際檢測(cè)。從市場(chǎng)購(gòu)買了5家公司的保鮮劑，將固體粉末分別用乙腈浸提一定時(shí)間后，超聲后經(jīng)高速離心取上清溶液待測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本次檢測(cè)的5個(gè)樣本中，僅有1個(gè)樣本呈現(xiàn)陽性，陽性樣品的典型色譜圖（圖4）。色譜圖清晰準(zhǔn)確，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖相一致（圖5），可滿足檢測(cè)要求。另外4種不同品牌的保鮮劑樣品均未檢出4-HR成分，其空白樣品色譜圖如圖6所示。對(duì)空白樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)峰處沒有響應(yīng)值，且基質(zhì)噪音響應(yīng)值較小，表明基質(zhì)在目標(biāo)質(zhì)譜質(zhì)量數(shù)附近不會(huì)造成干擾。實(shí)際樣品檢測(cè)表明本方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高。對(duì)于市售標(biāo)識(shí)含有4-HR的水產(chǎn)品保鮮劑中，是否達(dá)到標(biāo)識(shí)要求的含量，需要引起有關(guān)部門的高度重視。

圖4 陽性樣品中色譜圖（0.2 mg/kg）Fig.4 Chromatogram of positive samples（0.2 mg/kg）

圖5 0.5 μg/mL 4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of 4-HR standard solution（0.5 μg/mL）

圖6 空白樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank sample

3 總結(jié)

如今食品添加劑的種類越來越多，4-HR作為一種新型的抗氧化劑，在水產(chǎn)品加工、貯藏和保鮮的過程中廣泛使用，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定量有著重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究采用超高效液相色譜-熒光檢測(cè)法建立了水產(chǎn)品保鮮劑中4-HR的含量測(cè)定方法，方法穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度和精密度均符合檢測(cè)的要求，為市售標(biāo)識(shí)含4-HR的水產(chǎn)品保鮮劑的真?zhèn)翁峁┝艘环N準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。

[1]MCEVILY A J,IYENGAR R,OTWELL S.Sulfite alternative prevents shrimp melanosis[J].Food Technology,1991,45（9）:80-86.

[2]楊 峰,李學(xué)英,楊憲時(shí),等.常用水產(chǎn)保鮮劑對(duì)南極磷蝦品質(zhì)的影響研究[J].現(xiàn)代食品科技,2012，28（10）:1 285-1 289.

[3]邱豐艷,丁 力,陳雪梅.超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測(cè)定雞腿菇中4-己基間苯二酚的含量[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2016,52（5）:514-517.

[4]周會(huì)玲,魏 敏,唐愛君,等.4-己基間苯二酚對(duì)鮮切蘋果褐變及品質(zhì)的影響[J].食品研究與開發(fā),2013,34（8）:100-103.

[5]王 毓.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鮮切杏鮑菇中4-己基間苯二酚的含量[J].分析試驗(yàn)室,2015，34（8）:954-957.

[6]孫凱峰,周陶憶,顧蓓麗.蝦中4-己基間苯二酚的檢測(cè)技術(shù)研究[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26（3）:326-330.

[7]高 平,黃國(guó)方,黃 和,等.高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚[J].食品工業(yè)科技,2013,34（1）:304-308.

[8]SEL?UK A, ?ZDEN ?.A Rapid HPLC Method for Determination oF 4-hexylresorcinol Residues in Shrimp[J].Journal of Fisheries Sciences,2014,8（2）:131-138.

[9]唐利平,鄧啟華,謝家理.UPLC-MS/MS法測(cè)定蝦蟹中4-己基間苯二酚的殘留量[J].中國(guó)測(cè)試,2015，41（7）:60-63.

[10]余 穎.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定甲殼類水產(chǎn)品中4-己基間苯二酚殘留[J].福建水產(chǎn),2015,37（3）:227-232.

[11]KIM Y H,KIM J M,LEE J S,et al.Development and validation of an analytical method for the determination of 4-hexylresorcinol in food[J].Food Chemistry,2016,190（1）:1 086-1 092.

[12]段小娟,蔡 發(fā),牟志春,等.高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定蝦中的4-己基間苯二酚[J].食品科學(xué),2009,30（14）:238-239.