蛋氨酸灌胃制備高同型半胱氨酸血癥大鼠模型研究

代 淵，魏江平，潘 婷，秦莉霞，王曙賓，徐世軍△

(1. 成都中醫(yī)藥大學養(yǎng)生康復學院， 成都 611137； 2. 成都中醫(yī)藥大學藥學院， 成都 611137；3. 北京斯利安藥業(yè)有限公司, 北京 100176)

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, HHcy)是一種以血液中同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)含量持續(xù)高于正常水平(5～15 μmol/L)為特征的疾病，它由遺傳、環(huán)境因素、生活習慣和疾病狀態(tài)等因素所致[1]。目前制備HHcy 模型的動物種系繁多且造模方式多樣[2-3]。高濃度Hcy或蛋氨酸飲食(水)喂養(yǎng)是最常用的造模方法，但存在造模劑量不準確、原料浪費大、血清Hcy離散度大、模型不均一等不足。本研究通過參考文獻報道，采用同濃度蛋氨酸溶液自由飲水法平行對照，篩選在不影響脂代謝條件下制備HHcy的最適宜蛋氨酸灌胃劑量。

1 材料

1.1 實驗動物

21只SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20) g，四川省醫(yī)學科學院、四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所；20只SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20) g，成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 試劑與設備

L-蛋氨酸，山東西亞化學股份有限公司；甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)試劑盒，四川邁克生物科技股份有限公司；高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒，寧波美康生物科技股份有限公司；Hcy試劑盒，金華市強盛生物科技有限公司；日立7180型全自動生化分析儀，日本株式會社日立高新技術。

2 方法

2.1 分組及造模

大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質量隨機分為空白組、2%、1.5%、1%蛋氨酸灌胃組和2%、1.5%、1%蛋氨酸飲水組各3只。第4天開始造模，各組大鼠按照10 ml/kg灌胃給予相應藥物，每日2次，空白組和飲水組均給予等體積的純凈飲用水，連續(xù)灌胃6 周。灌胃組于第4周起按20 ml/kg灌胃給藥，飲水組第5周停止添加蛋氨酸觀察1周。根據(jù)前6周篩選結果，將20只大鼠根據(jù)體質量和血清Hcy含量隨機分成對照組和模型組進行重復性和穩(wěn)定性驗證，每組10只，灌胃4周，給藥體積20 ml/kg。

2.2 標本制備

造模前測定正常飲水量、飼料消耗量和血清Hcy含量1次，造模后記錄體質量、飼料日消耗量和飲水量，每周尾靜脈取血1次檢測血清Hcy及血脂4項含量。重復性實驗方法同上，但只檢測血清Hcy含量，2周1次。

2.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)2個獨立樣本t檢驗進行分析。

3 結果

3.1 各組大鼠體質量、日飼料消耗量、日飲水量變化

圖1顯示，第3周以后1%灌胃組體質量較空白組高，1.5%和2%飲水組大鼠在第2周以后均低于空白組，且2%飲水組在第4周顯著低于空白組(P<0.05)。第5周停止添加蛋氨酸后，飲水組體質量相對增加量大于空白組和灌胃組。

圖1 各組動物體質量變化比較 (單位：g)注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

表1顯示，各組大鼠的日飼料消耗量均逐漸下降，各灌胃組和1%飲水組第4、5、6 周日飼料消耗量都高于空白組，變化趨勢與體質量基本一致。表2顯示，各組大鼠的日飲水量均逐步下降，第3周后飲水組波動幅度較大。

表1 各組大鼠日飼料消耗量的變化比較 (g/100 g體質量)

表2 各組大鼠日飲水量的變化比較(ml/100 g體質量)

3.2 各組大鼠血清TC、TG、HDL和LDL含量變化

圖2顯示，與空白組比較，1%灌胃組在第3周、1%飲水組在第3、4周、1.5%飲水組在第5周和2%飲水組TC在第6周比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖3顯示，僅2%飲水組大鼠血清TG明顯升高(P<0.05)，其余各組無明顯變化(P>0.05)。

圖2 血清TC含量變化(mmol/L)注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖3 血清TG含量變化(mmol/L)

圖4顯示，與空白組比較，灌胃組與飲水組大鼠血清HDL含量比較差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)但有增加趨勢。圖5顯示，與空白組比較，除2%飲水組外(P<0.05)其余各組大鼠血清中LDL含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.3 各組大鼠蛋氨酸日攝入量和血清Hcy含量變化

圖4 血清LDL含量變化(mmol/L)注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖5 血清LDL含量變化(mmol/L)

表3顯示，第1～4周等濃度灌胃組和飲水組蛋氨酸日攝入量相差2～4倍，灌胃組調整給藥體積后，從第5周可以看出兩者蛋氨酸日攝入量相差不大。

表3 各組大鼠蛋氨酸日攝入量(g/3只)

圖6 血清Hcy含量變化(μmol/L)注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖6顯示，與空白組比較，灌胃組在第6周其血清Hcy比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而1.5%灌胃組在第5周比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而飲水組造模1周后血清Hcy含量起伏不定，各組內個體差異極大。值得注意的是，1%、1.5%飲水組血清Hcy含量在第5周前均曾恢復正常，停藥1周飲水組血清Hcy水平全部恢復至正常。

圖7 大鼠血清Hcy的影響(重復性實驗)注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖7顯示，在重復性實驗中與對照組比較，第2周起模型組大鼠血清Hcy差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明該法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好且個體差異小。

4 討論

本研究最初造模4周后，灌胃組大鼠血清Hcy含量未達到HHcy造模要求。由于蛋氨酸日攝入量相差2～4倍,因此后續(xù)實驗中灌胃組給藥體積增大1倍。灌胃組血清Hcy水平在2周內即達到Hhcy造模，要求且1.5%灌胃組Hcy含量升高最明顯。進一步重復性實驗表明，1.5%蛋氨酸灌胃法制備HHcy模型重現(xiàn)性好且較穩(wěn)定。相對而言，雖然飲水組血清Hcy含量較高，但個體差異極大且易恢復正常，說明飲水添加法制備HHcy模型不穩(wěn)定易反彈。

同時，2%蛋氨酸灌胃和1.5%、2%飲水可抑制動物生長即有毒性作用，而1.5%蛋氨酸灌胃和1%飲水添加對動物體質量影響不大即為適合的造模濃度。但飲水組的日飼料消耗量和飲水量低于灌胃組，且動物個體間蛋氨酸攝入量不均一，這可能是引起血清Hcy水平反彈的重要原因，也是導致模型動物個體差異較大的關鍵因素。再者,本研究中僅2%飲水組在第6周對血清TC、TG、LDL-C含量有較大影響，但這個濃度的蛋氨酸具有明顯的毒性作用；而灌胃法對大鼠血脂水平無明顯影響,但對其有增長趨勢，這可能與造模時間較短有關。此外本研究發(fā)現(xiàn)，停止添加蛋氨酸1周后，飲水組血清Hcy水平均恢復至正常，這提示蛋氨酸制備HHcy大鼠模型只適用于預防性給藥研究。綜上,本研究表明 1.5%蛋氨酸灌胃是制備HHcy大鼠模型較理想的方式，具有操作簡單、重現(xiàn)性好、模型穩(wěn)定不反彈、個體差異小、不影響動物生長和血脂水平等優(yōu)點，值得推廣使用。

[1] 那開憲.高同型半胱氨酸血癥診治中的一些誤區(qū)[J].中國臨床醫(yī)生雜志,2017,45(2):18-22.

[2] 劉新芳,姜雅秋.辛伐他汀對高同型半胱氨酸血癥模型大鼠急性心肌梗死再灌注后血清ET-1、AngⅠ、AngⅡ、CRP、MPO水平的影響[J].中國老年學雜志,2014,34(3):734-735.

[3] 吳樂,劉子建,黎紅華,等.普羅布考對高同型半胱氨酸血癥兔主動脈粥樣硬化及5-脂氧酶表達的影響[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2015,24(1):23-26.