左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠HPA軸及海馬糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響?

韓遠(yuǎn)山，趙洪慶，楊 蕙，杜 青，孟 盼，柳 卓，王宇紅△

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007； 2. 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長(zhǎng)沙 410208)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，影響著全球3.82億人的生活[1]。糖尿病患者易產(chǎn)生多種并發(fā)癥，其中糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetes mellitus with depression, DD)是導(dǎo)致患者自殺率最高的慢性并發(fā)癥之一[2]。據(jù)報(bào)道，DD患者自殺的可能性高達(dá)10%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通人群的0.01%～0.03%[3]。因此，開(kāi)展DD發(fā)病機(jī)制研究并進(jìn)行藥物防治具有重要意義。

研究表明，糖尿病和抑郁癥患者都存在顯著的神經(jīng)內(nèi)分泌改變，表現(xiàn)為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能亢進(jìn)，即HPA軸分泌的表現(xiàn)為腎上腺分泌的糖皮質(zhì)激素代謝紊亂，在海馬、下丘腦等部位與其受體結(jié)合，介導(dǎo)HPA軸負(fù)反饋功能障礙[3]。海馬組織作為最易受2型糖尿病高血糖影響的腦內(nèi)組織，對(duì)糖皮質(zhì)激素的過(guò)度表達(dá)異常敏感，糖皮質(zhì)激素代謝紊亂可能是DD發(fā)生的重要原因[4]。然而，DD狀態(tài)下HPA軸是否依然存在亢進(jìn)現(xiàn)象，糖皮質(zhì)激素及其受體(glucocorticoid receptor, GR)在關(guān)鍵靶部位海馬中是否會(huì)有明顯改變，均未見(jiàn)有相關(guān)研究。因此，本研究以HPA經(jīng)典指標(biāo)及海馬GR表達(dá)為切入點(diǎn)，探討左歸降糖解郁方對(duì)DD大鼠海馬組織的保護(hù)作用是否與調(diào)節(jié)HPA軸及糖皮質(zhì)激素受體有關(guān)，對(duì)DD的發(fā)病機(jī)制研究及其臨床防治都具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 藥物

左歸降糖解郁方由貫葉連翹、姜黃、熟地黃、黃芪、菟絲子等藥物組成，原藥材購(gòu)買(mǎi)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。二甲雙胍購(gòu)自湖南湘雅制藥有限公司(0.25 g/片×20片，批號(hào)1402115),氟西汀購(gòu)自禮來(lái)蘇州制藥有限公司(20 mg/粒×28粒，批號(hào)2087 A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK(湘)2013-0004]，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)附一院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(湘)2015-0003]。購(gòu)入大鼠后先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，期間自由飲水?dāng)z食。

1.3 試劑

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone, CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質(zhì)酮(Corticosterone, CORT)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司,STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,兔抗鼠GR一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司。

1.4 主要儀器

血糖測(cè)量?jī)x、血糖試紙(Johnson)；MK3型酶標(biāo)儀(Thermo)，5417R低溫高速離心機(jī)(Eppendorf)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica)，電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 大鼠分組及模型制備

75只SD大鼠中取10只作為正常對(duì)照組，剩余大鼠全部用于制備糖尿病模型。采用高脂灌胃聯(lián)合尾靜脈注射STZ(38 mg/kg)建立糖尿病模型，于STZ注射72 h后測(cè)定所有大鼠空腹血糖值。根據(jù)血糖測(cè)定結(jié)果，選取≥16.00 mmol/L的大鼠作為糖尿病模型大鼠，并將其隨機(jī)分為模型組、左歸降糖解郁方高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥組。分組完成后，繼續(xù)給予模型大鼠慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUMS)，應(yīng)激方法主要包括禁食或禁水24 h、冰水浴4 min、噪音4 h、50 V電擊3 min、光照或黑暗24 h、傾籠24 h、夾尾1 min、潮濕墊料24 h，每天隨機(jī)采用1～2種刺激，持續(xù)28 d，在抑郁造模期間所有大鼠均采用單籠飼養(yǎng)方法。

2.2 給藥

所有大鼠均在抑郁造模的同時(shí)給予灌胃給藥，其中左歸降糖解郁方高、中、低劑量對(duì)應(yīng)藥物濃度分別為32.82、16.41、8.20 g/kg，陽(yáng)性藥為臨床一線降糖藥二甲雙胍和抗抑郁藥氟西汀，對(duì)應(yīng)濃度分別為0.18 g/kg、1.8 mg/kg，正常組和模型組則分別給予蒸餾水，給藥體積均為10。末次給藥結(jié)束后1 h，對(duì)所有大鼠進(jìn)行血糖值、行為學(xué)測(cè)定，測(cè)試完成后采用水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，抗凝管中收集大鼠血漿，并取腦、海馬組織保存待用。

2.3 空腹血糖值測(cè)定

于測(cè)定前禁食6 h，采用剪尾取血法剪取大鼠尾根部動(dòng)脈血，血糖儀測(cè)定各組大鼠的空腹血糖值。

2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

參照課題組前期發(fā)表的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)[5]。

2.5 HE染色

取固定于4%甲醛溶液中的腦組織，常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色(HE染色)后顯微鏡下觀察、拍片，分析各組大鼠腦內(nèi)海馬組織的病理?yè)p傷情況。

2.6 ELISA檢測(cè)

采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血漿HPA軸指標(biāo)CRH、ACTH、CORT的含量，整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.7 Western-blotting實(shí)驗(yàn)

取冷凍保存的海馬組織，按每mg組織5ul比例加入RIPA裂解液，冰上勻漿、4 ℃12000 r/min離心15 min后,取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。按照Western-blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)大鼠海馬組織中GR蛋白表達(dá)量，采用ImageJ圖像分析軟件掃描各條帶，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白對(duì)應(yīng)灰度值的比值,作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血糖值及行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

表1顯示，與正常組比較，DD模型組大鼠血糖值顯著升高，強(qiáng)迫游泳測(cè)試不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)。與模型組大鼠比較，左歸降糖解郁方高、中劑量組大鼠血糖值均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，高劑量組大鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著降低(P<0.05)。

3.2 HE染色結(jié)果

圖1顯示，正常組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊，神經(jīng)元間隙正常。模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮，胞漿濃縮深染，呈一定的空泡狀，神經(jīng)元之間排列紊亂無(wú)序，間隙拉長(zhǎng)。陽(yáng)性藥和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠海馬空泡細(xì)胞數(shù)明顯減少，排列趨于整齊，神經(jīng)元損傷程度明顯減輕。

圖1 大鼠海馬組織HE染色結(jié)果(×400)注：A. 正常組；B. 模型組；C. 陽(yáng)性藥組；D. 左歸降糖解郁方高劑量組；E. 左歸降糖解郁方中劑量組；F. 左歸降糖解郁方低劑量組

3.3 ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量均顯著增加，HPA軸亢進(jìn)明顯(P<0.05)。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠血漿ACTH、CORT含量顯著降低(P<0.05)，CRH含量無(wú)明顯變化(P>0.05)，說(shuō)明模型大鼠的HPA軸亢進(jìn)狀態(tài)得到一定緩解。

表1 大鼠血糖值、行為學(xué)及HPA軸指標(biāo)結(jié)果比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.4 Western-blotting檢測(cè)結(jié)果

圖2顯示，模型大鼠海馬GR表達(dá)顯著降低(P<0.01)。在給予高劑量及中劑量的左歸降糖解郁方干預(yù)后，GR表達(dá)均有不同程度的回升(P<0.01或P<0.05)。

圖2 大鼠海馬GR蛋白的表達(dá)情況注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01A. 正常組；B. 模型組；C. 陽(yáng)性藥組；D. 左歸降糖解郁方高劑量組；E. 左歸降糖解郁方中劑量組；F. 左歸降糖解郁方低劑量組

4 討論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，其病機(jī)為陰虛燥熱，與肺、脾、腎有關(guān)；抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇，病位在肝，與心相關(guān)，氣血失調(diào)是其病機(jī)關(guān)鍵；而糖尿病并發(fā)抑郁癥繼發(fā)于糖尿病，其中醫(yī)病機(jī)可用“虛、瘀、郁”概括，表現(xiàn)為氣陰兩虛、瘀阻腦絡(luò)、血瘀肝郁、情志異常等。中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的中藥復(fù)方治療具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特性，且毒副作用小、療效持久，治療并發(fā)癥有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6]。左歸降糖解郁方是以《景岳全書(shū)》中左歸丸為基礎(chǔ)方，經(jīng)載化而得到的臨床經(jīng)驗(yàn)方。前期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方能明顯減輕DD大鼠的糖脂代謝紊亂及抑郁行為，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元突觸可塑性，降低其凋亡水平，延緩海馬損傷[5-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)DD大鼠血漿HPA軸相關(guān)指標(biāo)以及海馬中GR蛋白的表達(dá)，探討左歸降糖解郁方保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用機(jī)制。

血糖值作為糖尿病的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)，與糖尿病患者抑郁的發(fā)病率密切相關(guān)[8]。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)則是使動(dòng)物處于行為絕望狀態(tài)，被廣泛用于抗抑郁藥物的篩選[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方能明顯降低模型大鼠血糖值及不動(dòng)時(shí)間，具有良好的降血糖及抗抑郁效果。同時(shí)在給予藥物干預(yù)后，DD模型大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂、胞體腫脹等病理?yè)p傷情況得到緩解，進(jìn)一步說(shuō)明左歸降糖解郁方對(duì)海馬組織的保護(hù)作用。

HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的樞紐，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡起重要作用。研究表明，糖尿病與抑郁癥之間的一個(gè)共同發(fā)病機(jī)制是HPA軸功能紊亂[3,10]。糖尿病時(shí)，由于HPA軸基礎(chǔ)活性增高，使腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素增多，透過(guò)血腦屏障進(jìn)入到腦，而海馬是腦中最易受糖皮質(zhì)激素影響的組織，當(dāng)海馬中皮質(zhì)醇含量異常升高時(shí)會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，影響大腦的認(rèn)知功能進(jìn)而誘發(fā)抑郁產(chǎn)生[11]。

GR是一種廣泛分布于海馬組織內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體。生理情況下，海馬局部糖皮質(zhì)激素水平的升高通過(guò)與GR結(jié)合，發(fā)揮其對(duì)HPA軸的負(fù)反饋抑制作用。而糖尿病狀態(tài)下海馬GR表達(dá)下降，使其對(duì)HPA軸的抑制作用減弱，導(dǎo)致HPA軸晝夜節(jié)律消失，持續(xù)亢進(jìn)，分泌糖皮質(zhì)激素增加[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在給予左歸降糖解郁方干預(yù)后，模型大鼠血漿ACTH、CORT水平下降，海馬GR表達(dá)回升，說(shuō)明左歸降糖解郁方能通過(guò)上調(diào)GR表達(dá)保護(hù)海馬組織，發(fā)揮抗抑郁作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的抗抑郁藥物上調(diào)海馬GR水平相符合[13]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方發(fā)揮抗抑郁作用與緩解HPA軸高亢、上調(diào)海馬GR水平密切相關(guān)。本研究闡明了左歸降糖解郁方保護(hù)海馬組織的部分機(jī)制，為中藥復(fù)方治療糖尿病合并癥的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但該復(fù)方由多種中藥組成，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)等作用特點(diǎn)，其發(fā)揮治療作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及更多潛在的分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步的深入研究。

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