梔子、連翹等中藥配方顆粒體外肝細胞毒性研究*

任艷青 李葆林 田宇柔 牛麗穎 甄亞欽 王鑫國(石家莊 050091)

河北中醫學院 河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心

梔子、連翹等中藥配方顆粒體外肝細胞毒性研究*

任艷青 李葆林 田宇柔 牛麗穎 甄亞欽 王鑫國(石家莊 050091)

河北中醫學院 河北省中藥配方顆粒工程技術研究中心

目的：對梔子、連翹、大黃、續斷、首烏藤、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮10種中藥配方顆粒的體外肝細胞毒性進行研究評價。方法：以人正常肝細胞LO2為研究對象，設定一系列濃度梯度，MTT法觀察不同濃度配方顆粒對LO2細胞的細胞毒作用；Hoechst33258熒光染色法觀察細胞核形態。結果：100、1 000mg/L梔子配方顆粒對LO2細胞呈現明顯毒性作用(P<0.05或P<0.01)，熒光染色可見明顯的核熒光強度增強、固縮等凋亡表現；連翹等其他9種配方顆粒在0.001～1 000mg/L范圍內，對LO2細胞無明顯毒性作用(P>0.05)，也未觀察到明顯的細胞核形態學改變。結論：本研究以中藥配方顆粒作為體外實驗的載體，對梔子、連翹等10種常用中藥配方顆粒的早期肝毒性進行了評價，提示梔子配方顆粒若在較大劑量下使用，可能會存在明顯的肝臟毒性，其他9種中藥配方顆粒對人正常肝細胞LO2無明顯毒性，為上述中藥配方顆粒的臨床應用提供了參考。

中藥配方顆粒；梔子；連翹；大黃；續斷；首烏藤；麻黃；肝細胞毒性；安全性評價；LO2細胞

中藥配方顆粒是在中醫理論指導下，采用現代科技手段將傳統中藥飲片按一定的生產工藝制成的提取物與適當的輔料或藥材細粉制成的供臨床調劑使用的粉狀或顆粒狀產品。[1]目前關于中藥配方顆粒的研究多集中在化學成分分析、臨床應用、工藝和藥效學等方面，研究最少的是毒性和臨床安全性，[2]對中藥配方顆粒的安全性進行評價是配方顆粒研究中亟待解決的問題，中藥配方顆粒體外肝細胞毒性相關研究尚未見報道，本研究以中藥配方顆粒為載體，利用MTT、熒光染色技術，觀察了梔子、連翹、大黃、首烏藤、續斷、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮10種常用中藥配方顆粒對體外培養的人正常肝細胞LO2細胞毒性的影響，為上述藥物的臨床安全應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 梔子10g飲片/g配方顆粒，梔子苷含量126.9mg/g(每1g配方顆粒相當于臨床10g中藥飲片使用量，經高效液相檢測，每1g配方顆粒中梔子苷含量為126.9mg)，產品批號14081811；連翹14.3g飲片/g配方顆粒，連翹苷含量15.5mg/g，產品批號14090711；大黃2.4g飲片/g配方顆粒，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量之和為8.9mg/g，產品批號14121811；續斷9.1g飲片/g配方顆粒，川續斷皂苷VI含量67.1mg/g，產品批號15010411；首烏藤18.8g飲片/g配方顆粒，1,2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量40.3mg/g，產品批號15012811；麻黃10g飲片/g配方顆粒，鹽酸麻黃堿含量24.9mg/g，產品批號14082811；淫羊藿20g飲片/g配方顆粒，淫羊藿苷含量42.9mg/g，產品批號14100921；丹參5.6g飲片/g配方顆粒，丹酚酸B含量24.5mg/g，產品批號14081411；地黃5g飲片/g配方顆粒，梓醇含量18.8mg/g，產品批號14060911；陳皮6g飲片/g配方顆粒，橙皮苷含量6.7mg/g，產品批號14122121，以上配方顆粒均由石家莊神威藥業集團有限公司提供。

1.2 細胞 人正常肝細胞株LO2，購于中國醫學科學院腫瘤細胞庫。

1.3 試劑 高糖DMEM、胎牛血清(均購自美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(均購自美國Amresco公司)；Hoechst33258(美國ThermoFisherScientific公司)。

1.4 儀器MCO-15ACCO2培養箱(日本SANYO)；超凈工作臺(力康生物醫療科技控股有限公司)；TGL-16臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；DMI3000B倒置熒光顯微鏡(德國Leica)；MultiskanFC酶標儀(美國ThermoFisherScientific公司)。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養：快速將凍存的LO2細胞置于 37 ℃水浴復蘇，復蘇后800r/min離心5min，吸去上清加入5mL含 15%胎牛血清的高糖DMEM培養基，轉入培養瓶中培養。待細胞生長融合至80%匯合時即可進行傳代：棄舊培養基，1×PBS清洗細胞3次，0.25%胰酶消化，輕輕吹打細胞，待細胞分散后加入完全高糖DMEM培養基終止消化，1︰3傳代，細胞在37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.5.2 藥物配制：將連翹、大黃等10種中藥配方顆粒直接溶解于無血清高糖DMEM中，溶解性均良好，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，依次稀釋至工作濃度1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001mg/L。

1.5.3 細胞毒性檢測：生長狀態良好的LO2細胞消化后制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/mL，接種到96孔板，每孔100μL，細胞培養24h后換用無血清高糖DMEM培養基繼續培養24h使細胞饑餓，分裂活動停止，吸棄無血清培養基，每孔加入相應的藥物孵育24h，藥物作用時間結束后吸棄含有藥物的培養基，每孔加入新鮮無血清高糖DMEM培養基100μL、MTT20μL，置于培養箱中繼續培養4h，小心吸除上清，每孔加入100μLDMSO將結晶溶解，微量振蕩儀振蕩10min，使結晶充分溶解，酶標分析儀檢測各孔于492nm處的OD值。

1.5.4 細胞形態學染色觀察：參照文獻[3]方法，LO2細胞接種于96 孔培養板，每孔5 000個細胞，同步化24h，每種配方顆粒選定1、1 000mg/L兩個作用濃度，孵育細胞24h后棄掉含藥培養基，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定細胞10min，吸棄多聚甲醛，PBS再次漂洗3次，每孔加入終濃度為5μg/mL的Hoechst33258 染液100μL，室溫避光孵育10min，PBS輕輕漂洗2次，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

2 結果

2.1 梔子、連翹等10種中藥配方顆粒的LO2細胞毒作用 與空白對照組相比，0.01、0.1mg/L梔子配方顆?？擅黠@促進LO2細胞增殖(P<0.05或P<0.01)，但100、1 000mg/L梔子配方顆粒孵育細胞，OD值明顯下降，呈現出明顯的毒性作用(P<0.05或P<0.01)；連翹、大黃、續斷、首烏藤、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮9種配方顆粒在0.001～1 000mg/L范圍內對培養的LO2細胞均無明顯毒性作用(P>0.05)，1、10、100mg/L大黃配方顆粒、100、1 000mg/L續斷配方顆粒，1 000mg/L淫羊藿配方顆粒，10、100、1 000mg/L丹參配方顆粒孵育細胞，OD值顯著上升，體現出了明顯的促LO2細胞增殖作用(P<0.05)。詳見表1。

藥物OD值正常對照0.001mg/L0.01mg/L0.1mg/L1mg/L10mg/L100mg/L1000mg/L梔子0.42±0.0270.41±0.0280.49±0.056*0.51±0.032**0.46±0.0410.43±0.0550.34±0.048*0.20±0.028**連翹0.42±0.0480.51±0.0610.50±0.0610.45±0.0500.53±0.0480.47±0.0800.43±0.0700.44±0.092大黃0.37±0.0530.44±0.0250.42±0.0340.40±0.0340.49±0.052*0.50±0.075*0.48±0.030*0.42±0.056續斷0.43±0.0800.41±0.0560.47±0.0720.47±0.0860.51±0.1090.54±0.0680.57±0.075*0.58±0.052*首烏藤0.44±0.0480.45±0.0510.51±0.0810.47±0.0840.51±0.0720.46±0.0390.45±0.0600.46±0.056麻黃0.43±0.0630.49±0.0440.51±0.0730.50±0.0500.47±0.0510.42±0.0120.45±0.0490.47±0.078淫羊藿0.37±0.0240.42±0.0550.45±0.0840.45±0.0440.44±0.0470.46±0.0840.42±0.0530.49±0.067*丹參0.42±0.0500.43±0.0540.40±0.0390.43±0.0340.49±0.0700.51±0.058*0.54±0.053*0.57±0.061*地黃0.40±0.0260.45±0.0650.40±0.0200.44±0.0410.42±0.0350.43±0.0620.41±0.0270.39±0.028陳皮0.41±0.0370.38±0.0410.39±0.0180.40±0.0610.39±0.0330.37±0.0360.40±0.0350.36±0.034

注：與正常對照組比較，*P< 0.05,**P< 0.01

2.2 連翹、大黃等10種中藥配方顆粒對細胞核形態的影響 顯微鏡下觀察可見1 000mg/L梔子配方顆粒組細胞核濃染，并呈現出明顯的核固縮；其余各給藥組細胞與正常對照組細胞相比，細胞核形態無明顯差異，均未觀察到明顯的凋亡特征，細胞呈均勻淡染的藍色熒光，核形態完好，詳見圖1。

圖1 10種配方顆粒Hoechst 33258染色觀察(×200)

3 討論

肝臟是藥物產生毒性的重要靶器官，隨著中藥臨床的廣泛應用以及近年來中藥毒理學研究的不斷深入，中藥導致肝損傷的報道逐漸增多，越來越引起人們的重視，[4-5]中藥致肝毒性損傷已成為令人關注的熱點問題，[6]藥物的肝細胞毒性評價在早期毒理學評價中起著至關重要的作用。[7]中藥配方顆粒是利用先進的生產技術和現代分析測試方法對中醫傳統用藥方式所進行的一次變革，是對傳統中藥飲片的繼承和創新，它將推動我國中藥研究和生產的發展。建立中藥配方顆粒質量控制標準，解決中藥配方顆粒最基本的真偽鑒別、質量優劣及安全性評價等問題是中藥配方顆粒行業發展和國際化的當務之急，[8-9]中藥配方顆粒安全性的研究目前尚缺乏系統的研究資料，中藥配方顆粒體外肝細胞毒性相關研究尚未見報道，對中藥配方顆粒進行早期肝細胞毒性評價，是中藥配方顆粒研究中急需解決的問題。

近年來體外肝細胞在藥物的早期安全性評價中逐漸成為通用的肝毒性評價體外試驗工具，并廣泛應用于藥物細胞毒性的早期研究。[7]藥物對細胞毒性的評價可以從細胞生長和增殖活性、細胞形態學、細胞結構的損傷、細胞凋亡、細胞周期、細胞代謝功能和細胞的轉運功能等多個方面進行，[10-11]人正常肝細胞LO2目前已成為研究藥物肝毒性的重要細胞模型，[12]細胞水平的毒性篩選可快捷迅速的發現有潛在毒性的藥物，所以在中藥配方顆粒肝細胞毒性研究中，筆者采用體外實驗方法進行篩選，以MTT、細胞核熒光染色為手段，為藥物安全性評價提供先期的實驗依據。在MTT篩選中，為充分暴露其毒性反應，實驗中每種受試物的濃度涵蓋從較低的藥理學劑量到毒理學劑量，研究發現，連翹、大黃、續斷、首烏藤、麻黃、淫羊藿、丹參、地黃、陳皮9種常用中藥配方顆粒在0.001～1 000 mg/L范圍內對培養的LO2細胞均無明顯毒性作用，熒光染色也未觀察到細胞核受損后所發生的核固縮等典型的凋亡形態特征。實驗中筆者還發現，梔子配方顆粒0.01、0.1 mg/L，大黃配方顆粒1、10、100 mg/L，續斷配方顆粒100、1 000 mg/L，淫羊藿配方顆粒1 000 mg/L，丹參配方顆粒10、100、1 000 mg/L可促進LO2細胞增殖，提示上述中藥配方顆?？赡軐Ω渭毎哂幸欢ǖ谋Ｗo作用，但還有待進一步的研究，另外，實驗中還發現100、1 000 mg/L梔子配方顆粒孵育細胞，細胞毒性作用明顯，熒光染色也觀察到了核熒光強度增強、固縮等凋亡的典型特征，提示梔子配方顆粒若在較大劑量下使用，可能會存在明顯的肝臟毒性，其導致肝毒性的直接物質基礎及毒作用機制課題組目前正在進行深入的研究。綜上所述，本研究從體外細胞水平，采用細胞毒理學方法，探討了多種配方顆粒的體外肝細胞毒性，本研究為中藥配方顆粒的安全性評價提供了參考資料，并可為臨床安全應用提供參考。

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(2016-11-07 收稿)

*河北省自然科學基金資助項目：No.H2014206302；河北省高等學校科學技術研究項目：No.ZD2015001；河北省中醫藥 管理局科研計劃項目：No.2014007；河北中醫學院青年教師科研基金項目：No.QNZ2014007

王鑫國，男，教授，碩士研究生導師。

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1007-5615(2017)01-0043-04