壩上長尾雞IL- 2基因克隆與生物信息學分析

閆艷娟，李蘊玉，李佩國

(河北科技師范學院河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

白細胞介素2(interleukine- 2,IL- 2)是一類重要的淋巴因子，主要是由T- 淋巴細胞產生[1]。可促進哺乳類動物B細胞、T細胞的增殖、分化，還可以增強單核細胞和NK細胞的殺傷活性，在免疫系統具有十分重要的免疫生理調節效應，甚至可對神經系統發揮免疫調節作用[2]。1983年，T. Taniguchi 等[3]首次成功克隆人的IL- 2 基因，而后至少有30多個物種的IL- 2基因被相繼克隆成功。與人類和哺乳動物的IL- 2研究相比，雞IL- 2基因的研究比較滯后。一直到1997年，Sundick 等[4]首次獲得了雞IL- 2基因，使雞IL- 2的研究步入分子水平。雞IL- 2基因不僅在雞病防治和免疫方面有重要作用，還可以作為一種天然功能的細胞因子作用于動物，不存在動物產品的安全問題[5]。依據GenBank中的雞IL- 2的mRNA序列(JQ040532.1)，采用RT- PCR 方法擴增雞的IL- 2基因，并與GenBank 中所發表的序列如Leghorn SPF雞[6]、Kestrel來航雞、broiler雞、Obese雞、蕭山雞、貓、牛[7]、山羊[8]、人[9]的序列同源性進行比對，對氨基酸序列進行預測。壩上長尾雞距今已有300年的歷史，是唯一被列入中國畜禽遺傳資源志的地方品種，它是肉蛋兼用型的品種雞，具有耐粗飼、抗寒、抗病力強、肉味美等特點[10]，在市場上具有很高的需求，其產品具有非常廣闊的前景，因此對壩上長尾雞IL- 2基因的生物信息學進行分析，為進一步研究雞IL- 2基因的生物學功能、分子生物學和開展雞IL- 2 基因工程方面的研究提供依據，以及更好地對壩上長尾雞進行品種保護。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50日齡壩上長尾雞(BSCW)，由河北科技師范學院牧場提供。

1.2 主要儀器及試劑

eppendorf AG梯度PCR儀，由德國艾美德公司生產；德國Hettich公司生產的臺式高速冷凍離心機，型號為MIKRO220R；大腸桿菌DH5α感受態細胞，pMD18- T Vector，trizol，Tag酶，DL2000 Marker，反轉錄試劑盒，限制性內切酶(Hind Ⅲ，BamH Ⅰ)等試劑，由TaKaRa公司生產；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，由天根生化科技(北京)有限公司生產。

1.3 BSCW雞脾臟總RNA 的提取

雞頸部放血致死，無菌采取脾臟組織，用液氮研磨，然后加trizol試劑1 mL，一步法提取雞脾臟總RNA，具體方法參照文獻[11]。

1.4 BSCW雞IL- 2基因的RT- PCR擴增

依據GenBank中的雞IL- 2的mRNA序列(JQ040532.1)，利用Primer5.0設計1對特異性引物，引物序列P1：5’- CCGAATTCATGATGTGCAAAGTACTG- 3’，P2：5’- ATGCGGCCGCCCGCGGGGATCCACGCGT-TTTTTGCAGATATCTCACAAAG- 3’。使用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR 擴增，反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。用質量濃度10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。

1.5 IL- 2基因的克隆

對上述的PCR產物進行回收，取4.5 μL與載體pDM18- T Vector 0.5 μL相連接，并加入SolutionⅠ5.0 μL，16 ℃連接4 h。經DH5α感受態細胞轉化，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選培養，挑取陽性菌落進而提取重組質粒。

1.6 重組質粒的鑒定

用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ對提取的重組質粒進行雙酶切鑒定及PCR鑒定。

1.7 BSCW雞IL- 2基因的序列測序和分析

經含有氨芐青霉素的LB平板篩選得到的陽性菌落在液體LB中搖菌后菌液直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，應用DNAstar，MEGA 5.1，DNAMAN等軟件對測序的BSCW雞IL- 2基因進行同源性比較及進化樹分析。

1.8 BSCW雞IL- 2基因編碼蛋白質的生物信息學分析

利用ProtParam，DNAstar，Swiss Model 等軟件對BSCW雞IL- 2 基因編碼蛋白質的理化性質、疏水性、二級結構和三級結構進行預測。

2 結 果

2.1 RT- PCR擴增結果分析

用質量濃度10 g/L的瓊脂糖電泳對RT- PCR擴增產物進行分析，可見一條長度約為432 bp的條帶，與預期基因片段大小相同(圖1)。

圖1 BSCW雞IL- 2基因RT- PCR擴增

2.2 IL- 2 基因的克隆與重組質粒的鑒定

對篩選到的陽性重組質粒pMD18- T- IL- 2進行PCR鑒定及BamH Ⅰ，Hind Ⅲ雙酶切鑒定。PCR鑒定可見在432 bp的位置有特異性條帶，雙酶切鑒定顯示有2條條帶(圖2，圖3)，一條長度約為432 bp，另一條長度約為2 600 bp的載體片段，說明BSCW雞IL- 2基因成功克隆到pMD18- T載體中。

2.3 BSCW雞IL- 2基因序列測定及分析

雙酶切鑒定為陽性的重組質粒測序結果表明，BSCW雞IL- 2基因CDS區全長432 bp，含有1個432 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼143個氨基酸，與GenBank中序列相比有6個堿基發生了突變(圖4)。用DNAMAN 軟件將克隆得到的BSCW雞IL- 2氨基酸序列與GenBank中發表的雞IL- 2氨基酸序列進行比對，在28，30，32，120 位有4個氨基酸的差異(圖5)。

圖2 重組質粒的PCR鑒定 圖3 pMD18- T- IL- 2重組質粒的雙酶切鑒定

圖4 BSCW雞IL- 2基因測序結果

圖5 BSCW雞IL- 2氨基酸序列與GenBank中雞IL- 2氨基酸序列對比

2.4 BSCW雞IL- 2基因的同源性比較及進化樹分析

克隆得到的BSCW雞IL- 2基因與GenBank中發表的雞IL- 2的核苷酸序列同源性為95%，氨基酸同源性為97.2%；與Leghorn SPF雞、Kestrel來航雞、broiler雞、Obese雞、蕭山雞、貓、牛、山羊、人的IL- 2核苷酸序列同源性分別為98.1%，95.0%，94.1%，93.9%，94.1%，45.3%，48%，47.5%，41.7%(圖6)，與其氨基酸序列同源性分別為97.2%，96.7%，8.1%，9.6%，94.7%，12.3%，14.1%，17.1%，10.2%(圖7)。從進化上看，BSCW雞的IL- 2基因與Leghorn SPF雞、Kestrel來航雞、broiler雞、Obese雞、蕭山雞距離比較近(圖8)，與其他哺乳動物的IL- 2基因距離比較遠(圖9)。

圖6 IL- 2基因的同源性比較

圖7 IL- 2基因推導的氨基酸序列的同源性比較

圖8 IL- 2基因序列的進化樹分析

圖9 IL- 2基因推導的氨基酸序列的進化樹分析

2.5 BSCW雞IL- 2基因編碼的蛋白質生物信息學分析

2.5.1IL-2基因編碼的蛋白質的理化性質及疏水性預測 應用ProtParam軟件對IL- 2蛋白分子進行分析可知，分子質量為37 499.95 ku，理論等電點(PI)為5.24，分子式為C1 393H2 330N458O570S90。序列中帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)有20個，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)有19個。該蛋白的半衰期為4.4 h，不穩定系數為48.23，為不穩定蛋白；該蛋白脂溶性為36.03，平均親水指數為0.89，該蛋白為親水蛋白。

2.5.2IL-2基因編碼的蛋白質的二級結構預測 通過DNAStar對IL- 2 基因推導的氨基酸序列進行蛋白質二級結構預測及抗原性分析，結果顯示，IL- 2基因推導的蛋白的空間結構具有6個α螺旋，4個β折疊，10個轉角和3個無規則卷曲(圖10)。疏水性分析發現，IL- 2基因推導的蛋白質具有較強的親水性，只有一個強疏水位點，在第10，第11位氨基酸處。

2.5.3IL-2基因編碼的蛋白質的三級結構預測 該蛋白三級結構與二級結構預測基本一致，主要由6個α螺旋結構和4個β折疊構成(圖11)。

圖10 IL- 2基因編碼的蛋白質的二級結構預測

圖11 IL- 2基因編碼的蛋白質的三級結構預測

3 結論與討論

通過對BSCW雞IL- 2基因與另外幾種脊椎動物的IL- 2核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行同源性比較和進化樹分析，結果表明，測出的BSCW雞的IL- 2基因與GenBank上發表的IL- 2基因的同源性分別為95.0%和97.2%。從進化上分析，二者在進化樹上的距離較為接近，說明在系統進化過程中在相同的分支上，親緣關系相對較近；與其他種屬的同源性較低，親緣關系較遠。

IL- 2主要是由T淋巴細胞產生的一類細胞因子，在免疫調節、抗病毒及感染性疾病的治療中都有重要作用。依據GenBank中發表的雞IL- 2基因的高度保守區序列，通過Primer 5.0軟件設計一對特異性引物，克隆IL- 2基因的開放閱讀框，結果顯示，由432個核苷酸組成，編碼143個氨基酸。測序結果也證實成功克隆了IL- 2基因，為進一步研究IL- 2基因的生物信息學功能及作為DNA疫苗的免疫增強劑提供依據。與GenBank上發表的IL- 2基因序列相比，克隆得到的序列有6個堿基發生變異，這6個堿基的變異導致編碼的蛋白序列有4個氨基酸發生變異。

通過分子生物學軟件對BSCW雞IL- 2基因所編碼的蛋白質進行了理化性質、疏水性、二級結構及三級結構預測分析。理化性質顯示，編碼的蛋白質相對分子質量為37 499.95 ku，等電點為5.24。疏水性結果顯示，推導的蛋白質具有很好的親水性，有1個強疏水位點，在第10，第11位氨基酸處。二級結構預測結果分析顯示，該基因編碼的蛋白質具有6個α螺旋，4個β折疊，10個轉角和3個無規則卷曲的復雜結構。三級結構預測得到的結果和二級結構一致。

[1] 謝昆,蔣成硯,胡俊杰,等.雞IL-2基因的克隆、序列分析及蛋白結構預測[J].中國農學通報,2011,27(14):5- 11.

[2] Eitan S,Schwartz M.A transglutaminase that converts interleukin- 2 into a factor cytotoxic to oligodendrocytes[J].Science,1993,261:106.

[3] Taniguchi T,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin- 2[J].Nature,1983,302(5 906):305- 310．

[4] Molloy M J,Zhang W,Usherwood E J.Cutting edge: IL- 2 immune complexes as a therapy for persistent[J].Immunol,2009,182(8):4 512- 4 515.

[5] 于新友,趙蕾,王艷,等.雞白細胞介素- 2分子生物學和疾病防治應用研究進展[J].中國畜牧獸醫,2011,38(8):81- 84．

[6] 舒秀偉,宣華,衛廣森.雞IL- 2基因的克隆與序列分析[J].中國獸醫科技,2005(7):555- 560.

[7] Reeves R,Spies A G,Nissen M S,et al.Molecular cloning of a functional bovine interleukin- 2 cDNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(10):3 228- 3 232.

[8] Seow H F,Rothel J S,Radford,et al.The molecular cloning of ovine interleukin- 2 gene by the polymerase chain reaction[J].JOURNAL Nucleic Acids Res,1990,18(23):717

[9] Dukovich M,Wano Y,Bryan R,et al.A second human interleukin- 2 binding protein that may be a component of high- affinity interleukin- 2 receptors[J].Nature 327,518- 522.

[10] 王亞男,馮曼,郭建軍,等.影響壩上長尾雞蛋品質的相關因素研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2017(06下):71- 73.

[11] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].第3版.金冬雁,黎孟楓，譯.北京:科學出版社,2002:132- 138.