胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白W自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建

陳夏冰++陳潔++付書林

摘要：胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一種能夠引起豬傳染性胸膜肺炎的細(xì)菌病原體，它給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。外膜蛋白W（OmpW）在細(xì)菌的生命活動(dòng)中起著重要作用，大量研究表明OmpW與細(xì)菌的感染、耐藥性以及分子調(diào)節(jié)等都有著緊密聯(lián)系，因而闡明ompW基因?qū)π啬し窝追啪€桿菌調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于該疾病的防控具有重要意義。以胸膜肺炎放線桿菌ompW基因?yàn)檠芯繉?duì)象，成功構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pEM-OmpW，為構(gòu)建胸膜肺炎放線桿菌OmpW突變株以及探究ompW基因?qū)π啬し窝追啪€桿菌分子調(diào)節(jié)機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）；外膜蛋白W；自殺性質(zhì)粒

中圖分類號(hào)：Q813；S855.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0157-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.040

Constructing the Suicide Plasmid of OmpW of Actinobacillus pleuropneumoniae

CHEN Xia-bing1，CHEN Jie1，F(xiàn)U Shu-lin1，2，HE Bin1，SHAO Zhi-yong1，YAO Yan-feng1，

YANG Wen-hai1，LIU Wu1，JIN Er-guang1，TONG Wei-wen1，TAO Bi-fei1

（1.Wuhan Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Wuhan 430208，China；

2.School of Animal Science and Nutritional Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

Abstract： Actinobacillus pleuropneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia， a highly contagious respiratory disease of pig which causes serious economic losses. Outer membrane protein W（OmpW） plays a very important role in the life activities of bacteria. A large number of studies have indicated that OmpW is closely related to bacterial infection， drug resistance and molecular regulation. Therefore， it is important to elucidate the regulation mechanism of ompW gene in the prevention and control of the disease. The ompW gene of APP was studied and the suicide plasmid pEM-OmpW was successfully constructed， which providing the basis of constructing ompW gene deletion mutant and exploring OmpW regulating the molecular pathogenesis of APP.

Key words： Actinobacillus pleuropneumoniae；OmpW；suicide plasmid

胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是巴斯德科放線桿菌屬的一種豬呼吸道病原菌，引起豬的傳染性胸膜肺炎，臨床上表現(xiàn)為纖維素性胸膜肺炎及出血性、纖維素性、壞死性肺炎等主要病理學(xué)特征[1]。自1957年P(guān)attison首次報(bào)道以來(lái)，該病在大多數(shù)養(yǎng)豬國(guó)家或地區(qū)流行，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白（OMPs）作為外膜中的重要成分，是細(xì)胞膜通透性與外排泵系統(tǒng)的直接承擔(dān)者，在穩(wěn)定細(xì)菌外膜的結(jié)構(gòu)、適應(yīng)胞內(nèi)外環(huán)境和抵抗胞內(nèi)殺菌機(jī)制等方面起著重要作用，與細(xì)菌的毒力有密切關(guān)[3]。在APP中ompW基因編碼215個(gè)氨基酸的外膜蛋白，屬于表面抗原2家族，其功能是未知的，該家族包括一些表達(dá)革蘭氏陰性菌表面抗原的蛋白，為孔蛋白家族，形成桶狀通道[4]。該基因在APP中高度保守，為全面了解其在不同血清型APP中的作用機(jī)制提供了方便。本試驗(yàn)參照已測(cè)序APP血清3型JL03菌株基因組序列，設(shè)計(jì)引物以APP 4074菌株為模板，擴(kuò)增ompW基因，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。成功構(gòu)建APP外膜蛋白W自殺性質(zhì)粒，為構(gòu)建ompW基因缺失突變菌株提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為探究ompW基因?qū)π啬し窝追啪€桿菌分子調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、Ex Taq/LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、RNase酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloramphenicol，Cm）溶液均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。DNA回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）粉劑購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson and Company公司。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 胸膜肺炎放線桿菌血清1型4074菌株和自殺性質(zhì)粒pEMOC2由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 4074菌株中ompW基因上下游同源臂的測(cè)序 參照已測(cè)序APP血清3型JL03菌株基因組序列，設(shè)計(jì)引物P1、P2，以APP 4074菌株為模板，擴(kuò)增ompW基因及其上下游同源臂，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)OmpW1/OmpW2、OmpW3/OmpW4兩對(duì)引物，以APP 4074菌株為模板，PCR擴(kuò)增ompW基因的上下游同源臂。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)、回收，連接到pMD-18T載體上構(gòu)建T-O1和T-O2，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-OmpW的構(gòu)建 將測(cè)序正確的T-O1用限制酶XbaⅠ、SalⅠ從pMD18-T載體切下，連接到經(jīng)相同酶酶切的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEMOC2上，然后轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取重組質(zhì)粒pEM-O1，再將測(cè)序正確的T-O2用NotⅠ、XbaⅠ從pMD18-T載體上切下，連接到經(jīng)相同酶酶切的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-O1上，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒鑒定正確，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-OmpW。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompW基因及上下游序列保守性分析

APP血清1型菌株4074的ompW基因及上下游序列測(cè)序結(jié)果顯示，該片段與JL03、L20、AP76都有很高的同源性，分別達(dá)到99%、99%、98%（圖1）。

2.2 ompW基因上下游同源臂的擴(kuò)增

以APP 4074菌株基因組為模板擴(kuò)增ompW基因的上下游同源臂，擴(kuò)增結(jié)果得到分別為1 006、1 064 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果大小相同。回收純化并將目的片段連接到pMD-18T載體上，送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，與APP 4074菌株測(cè)序結(jié)果相比相似性達(dá)到100%（圖2、圖3）。

2.3 重組轉(zhuǎn)移自殺性質(zhì)粒pEM-OmpW的構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEM-O1用XbaⅠ/SalⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，得到1 006 bp左右的目的片段，與上游同源臂相符合，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pEM-O1構(gòu)建成功（圖4）。然后，再將構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-OmpW用NotⅠ/SalⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果切下與目的片段（包括上下游同源臂）2 070 bp大小相符的片段，表明重組自殺性質(zhì)粒pEM-OmpW構(gòu)建成功（圖5）。

3 討論

ompW基因編碼的蛋白OmpW屬于外膜蛋白的一種，是細(xì)菌感染的主要抗原之一。大量的研究結(jié)果表明，外膜蛋白在物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能夠幫助菌體逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的捕殺、提高對(duì)環(huán)境的耐受。在不同的細(xì)菌中，OmpW與細(xì)菌的感染、耐藥性以及分子調(diào)節(jié)等有緊密聯(lián)系[5]。有研究表明，鐵離子可通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Fur來(lái)影響OmpW的表達(dá)：在大腸桿菌中上調(diào)表達(dá)[6，7]，在希瓦氏菌中下調(diào)表達(dá)[8]。此外，在霍亂弧菌中，滲透壓對(duì)OmpW表達(dá)有較大的影響[9]。Hu等[10]研究了1株對(duì)頭孢曲松有抗性的鼠傷寒沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)OmpW可能參與這種抗生素的吸收。在肺炎克雷伯菌中也被證實(shí)是候選疫苗和藥物靶標(biāo)[11]。將立克次氏體的重組蛋白OmpW免疫小鼠，能夠得到很好的免疫原性，減少肺部等臟器的載菌量，試管中和試驗(yàn)中也顯示出免疫OmpW的小鼠血清，能夠減少立克次氏體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的附著和侵染[12]。在鼠傷寒沙門氏菌中，SoxS與MarA參與調(diào)控ompW基因的表達(dá)，其缺失突變將導(dǎo)致ompW基因的下調(diào)表達(dá)：AraC家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SoxS可激活OmpW對(duì)白枯草的抗性，而同屬該家族的MarA與SoxS綁定在一起形成marsox箱，增加SoxS對(duì)ompW啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的親和力，共同直接調(diào)控ompW基因的表達(dá)[13]。因此，OmpW在病原菌感染、耐藥性以及分子調(diào)節(jié)等過(guò)程中起著重要作用。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建胸膜肺炎放線桿菌ompW基因突變株，詳細(xì)研究ompW基因?qū)π啬し窝追啪€桿菌調(diào)節(jié)機(jī)制，詮釋外膜蛋白在病原微生物重要生命活動(dòng)過(guò)程中全局性的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，為今后胸膜肺炎放線桿菌新型疫苗的開(kāi)發(fā)和藥物靶標(biāo)的篩選提供理論依據(jù)。

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