葛根素對IL—1β損傷大鼠關節軟骨細胞一氧化氮及一氧化氮合成酶的影響

楊洋+劉勇

摘要：目的 觀察葛根素（Pue）對IL-1β損傷大鼠關節軟骨細胞一氧化氮的影響。 方法 取雌性10日齡大鼠膝關節軟骨作體外細胞培養，培養后軟骨細胞隨機分成正常組、L-1β組、地塞米松組、Pue50組、Pue100組、Pue200組等6組。后5組分別加入IL-1β（5 μg/L）10 μmol、IL-1β（5 μg/L）10 μmol +地塞米松10-9 mol、IL-1β（5 μg/L）10 μmol +Pue50 μmol/L、IL-1β（5 μg/L）10 μmol+ Pue100 μmol/L、IL-1β（5 μg/L）10 μmol+Pue200 μmol/L，使用南京建成生物工程研究所的一氧化氮（NO）試劑盒和一氧化氮合成酶（iNOS）試劑盒檢測NO含量和iNOS活性。 結果 6組軟骨細胞的NO含量（μmol/L）分別為1.351、12.162、4.054、9.459、6.757、5.405，后4組與IL-1β組比較有明顯差異（P<0.05），且隨著劑量上升（50、100、200 μmol/L），軟骨細胞分泌的NO的含量越少。6組軟骨細胞的iNOS含量（U/mL）分別為0.535、1.069、0.713、1.069、0.891、0.713，后4組與IL-1β組比較有明顯差異（P<0.05），且隨著劑量上升（50、100、200 μmol/L），iNOS活性越低。 結論 葛根素是一良好的NO清除劑，其通過降低iNOS活性，減少NO生成，以達到保護關節軟骨細胞的目的，為防止骨性關節炎提供理論依據。

關鍵詞：葛根素；軟骨細胞；IL-1β；iNOS活性；NO含量

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）02-0083-03

【Abstract】Objective： To observe the effect of puerarin on nitric oxide （NO） of articular chondrocytes in rats with IL-1β-induced injury. Methods： Chondrocytes were isolated from female 10-day-old rats and cultured in vitro. The chondrocytes were randomly divided into a normal group， a L-1β group， a dexamethasone group， a Pue50 group， a Pue100 group and a Pue200 group. The latter five groups were respectively given （5 μg/L） 10 μmol， IL-1 β （5 μg/L） 10 μmol+dexamethasone 10 μmol， IL-1 β （5 μg/L） 10 μmol/L， 10 μmol+Pue 100 μmol/L and 10 μmol+Pue 200 μmol/L of IL-1β （5 μg/L） and NO kit and iNOS kit made by Nanjing Jiancheng Biology Engineering Institute were used to detect NO content and iNOS activity. Results： The NO content （μmol/L） of chondrocytes of the six groups was 1.351， 12.162， 4.054， 9. 459， 6.757 and 5. 405 respectively. There were significant differences between the latter four groups and IL-1β group （P<0.05） （50 μmol/L， 100 μmol/L， 200 μmol/L）. With the rising of dose（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）， the content of NO produced by chondrocytes decreased. The iNOS content （U/mL） of the six groups of chondrocytes was 0.535， 1.069， 0.713， 1. 069， 0.891and 0.713 respectively. The iNOS content of the latter four groups were significantly different from those of IL-1β group （P<0.05）. With the rising of the dose （50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）， the activity of iNOS became lower. Conclusion： Puerarin is a good NO scavenger， which can protect the articular chondrocytes by lowering iNOS activity and decreasing NO production， which provides a theoretical basis for preventing osteoarthritis.

【Key words】puerarin， chondrocyte， IL-1β， iNOS activity， NO content

骨性關節炎（OA）是一種常見的，以關節軟骨變性為其特征的慢性骨關節病。研究表明OA時關節軟骨細胞及滑膜內一氧化氮（NO）水平明顯升高[1]，NO通過抑制關節軟骨細胞蛋白多糖的合成，導致關節軟骨逐漸粗糙而發生退變[2]。NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，而其中誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）與OA關系密切。iNOS表達較高時則能催化NO水平持續升高。葛根素（Puerarin，Pue）是中藥葛根的提取物，也是葛根的主要有效成份之一，在上一部分實驗中證實葛根素可以保護IL-1β損傷的軟骨細胞，并促進其增殖。現在筆者根據葛根素的作用和OA的發病機制，來探討葛根素對IL-1β損傷軟骨細胞的作用機制：可能是通過降低iNOS活性從而減少NO的合成來達成的。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設備 SPF級10日齡大鼠（武漢同濟醫學院實驗動物中心提供）、CO2恒溫培養箱（日本SANYO公司）、超凈工作臺（蘇凈安泰）、生物倒置顯微鏡（重慶光電儀器總公司）、752紫外分光光度計（上海民怡儀器儀表有限公司）、臺式離心機（Heal Force）、微型漩渦混合器（上海凌儀實業有限公司）、恒溫水浴鍋（武漢金寶華科技有限公司）、移液槍（上海佳安分析儀器廠）。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養基（美國Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、胰蛋白酶（Amresco公司）、II型膠原酶（北京博奧森生物技術有限公司）、重組大鼠白介素-1β（rratIL-1β，PeproTech公司）、地塞米松磷酸鈉注射液（Solarbio公司）、葛根素標準品（Sigma公司）、無鈣鎂磷酸緩沖液（PBS）、一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所）、誘導型一氧化氮合成酶（南京建成生物工程研究所）。

1.3 軟骨細胞的原代培養及傳代 取SPF級10日齡大鼠，脫頸處死后，在無菌條件下取出髖膝關節處的軟骨組織塊，于超凈工作臺內置入含10%雙抗的PBS培養皿中，清洗一遍，再用不含雙抗的PBs清洗三遍。然后將軟骨組織塊移入EP管，向EP管中滴入2-3滴PBS，然后用眼科剪將組織塊剪至約1 mm3大小。將EP管中的PBS吸出，加入0.2%Ⅱ型膠原酶使組織塊處于懸浮狀態，置于37℃條件下消化過夜。消化完成后，將EP管在振蕩器上振蕩2 min，使消化下來的細胞從組織中離散。離心棄上清，取出下層細胞加入盛10%胎牛血清的DMEM/F12培養瓶中，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。72 h后更換培養液，觀察細胞生長情況，以后隔2天更換1次培養液，當細胞長滿單層的80%-90%左右后進入傳代培養。

達到傳代條件后，將培養瓶中的培養液吸棄，用PBS沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化5 min左右，在倒置顯微鏡下見細胞變圓后，立即棄去消化液終止消化，加入含血清的培養液沖洗、吹打，使細胞懸浮起來，根據需要調節細胞濃度分瓶接種于新的培養瓶中。置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。

1.4 實驗分組 ①正常軟骨細胞組；②IL-1β組，按濃度5 μg/L加入IL-1β10 μmol；③IL-1β（5 μg/L）10 μmol +地塞米松（10-9 mol/L）；④、⑤、⑥IL-1β（5 μg/L）10 μmol +葛根素50、100、200 μmol/L。

1.5 實驗方法 取生長良好的傳代軟骨細胞，用0.25%胰蛋白酶常規消化，用培養液配制成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔加200 μL，置于37℃，5% CO2恒溫培養箱中。待培養24 h細胞貼壁后，分別加入含IL-1β和藥物的培養基，共設6組，每組3孔。培養24 h后用南京建成生物工程研究所的NO試劑盒和iNOS試劑盒檢測NO含量和iNOS活性，具體操作方法按試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理 所有數據均由SPSS 17.0軟件進行處理，計量資料采用（x±s）表示，2組間比較采用兩樣本均數t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NO含量的檢測 IL-1β能損傷軟骨細胞，增加NO的釋放量，同正常組比較有顯著差異性（P<0.01）。地塞米松和葛根素均能顯著減少NO的生成，而葛根素減少NO的生成呈劑量依賴性，劑量越高，分泌的NO越少，見表1。

2.2 iNOS活性的檢測 IL-1β損傷軟骨細胞后增強了iNOS的含量，同正常組相比差異有意義（P<0.05），地塞米松和葛根素均能顯著降低iNOS的含量（P<0.05），而葛根素降低iNOS的含量呈劑量依賴性，劑量越高，iNOS含量越低，表明葛根素能降低iNOS活性，同時葛根素劑量越高，iNOS活性越低，見表2。

3 討論

骨性關節炎（OA）又稱骨關節病、退行性關節病、老年性關節炎等，是一種常見的以關節疼痛、腫脹、僵硬和畸形為特點，以關節軟骨變性為其特征的慢性骨關節病。我國正在進入老齡化社會，因而老年OA的發病率也呈逐年上升的趨勢，是老年人關節疼痛和致殘的主要原因[3]。一般認為OA是在力學和生物學等因素的共同作用下，由于軟骨細胞、細胞外基質（ECG）及軟骨下骨三者之間分解和合成代謝失衡，從而引起軟骨損害、滑膜炎性改變為特點的疾病。本病發病核心是從關節軟骨退行性改變逐步累及軟骨下骨質、滑膜、關節囊等關節重要結構。其中關節軟骨的退行性改變是骨性關節炎發病的病理基礎和核心。關節軟骨由較骨細胞和細胞外基質組成，幾乎所有的致病因素均是通過影響這二者而致病的。近年發現，細胞因子、蛋白酶分泌異常，導致軟骨退變，是骨性關節炎發病中心環節[4]。

一氧化氮（nitric oxide，NO）作為一種氣體自由基，其產生路徑有很多，其能對細菌和腫瘤細胞產生殺傷作用，同時正常組織也能被NO刺激而造成損傷[5]。骨性關節炎時關節軟骨會產生大量的NO，而NO會對軟骨產生有害作用，主要表現于對蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成與分泌的抑制。NO是由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，而NOS可以分為三種，分別是誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和神經元型一氧化氮合成酶（nNOS），其中iNOS與OA關系密切。Amin等在OA患者的關節軟骨細胞中發現iNOS高表達，認為iNOS是由特定細胞因子誘導合成的，如IL-1β、腫瘤壞死因子、和γ-干擾素等[6]。iNOS表達較高時則能催化NO水平持續升高，而NO通過抑制關節軟骨細胞蛋白多糖的合成，造成軟骨損傷，最終導致OA的發生[7]。

筆者在試驗發現，軟骨細胞在受到IL-1β刺激后iN0S活性增強，NO生成大量增加，印證了前期的實驗研究。本實驗證實IL-1β損傷的大鼠關節軟骨細胞N0生成遠遠超過正常組，iNOS生成也遠遠超過正常組，反映了NO體系在受到IL-1β刺激后的連鎖反應，結合前一實驗中IL-1β損傷組軟骨細胞增殖率的降低，印證了NO體系受到IL-1β刺激后發生連鎖性的反應，通過NO損傷軟骨細胞。由實驗結果可以看出，地塞米松和葛根素在一定范圍內都有清除N0、降低iNOS活性的效應，而葛根素保護效應呈明顯的劑量依賴性。在本實驗中，葛根素作為良好的NO清除劑，其通過降低iNOS活性，減少NO生成，以達到保護軟骨細胞的目的，為葛根素的臨床應用提供了理論依據。

參考文獻：

[1]王林，王大壽，穆瓊，等.臭氧治療對家兔骨性關節炎病變及NO含量的影響[J].貴陽醫學院學報，2010，35（4）：349-351.

[2]王聲.一氧化氮合成酶在骨關節炎研究中的新進展[J].中國現代藥物應用，2012，6（19）：117.

[3]趙錦松，李小霞.骨性關節炎的臨床表現與診斷[J].解放軍保健醫學雜志，2005，3（7）：135-137.

[4]Yu LP Jr，Smith GN Jr，Hasty KA，et al.Doxycycline inhibits type Ⅺ collagenolytic activity of extracts from human osteoarthritic cartilage and of gelatinase[J].Rheumatol，1991，18：1450-1452.

[5]Moilanen E.Nitric oxide in inflammation and immune response[J].Ann Med，1995，27：359-367.

[6]Amin AR，di Cesare PE，Vyas P，et al.The expression and regulation of nitric oxide synthase in human osteoarthritis-affected chondrocytes：evidence for up-regulated neuronal nitric oxide synthase[J].Exp Med.1995，182：2097-2102.

[7]李勇光，鄭婧，高宇，等.臭氧對骨性關節炎實驗兔軟骨細胞iNOS及MMP-1表達的影響[J].中華物理醫學與康復雜志，2012，34（6）：472-473.

（收稿日期：2016-09-18）