40種中藥材提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用

芶*

（1.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

40種中藥材提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用

芶劍渝1,2，彭玉龍1，張長華1，夏艷2，孔凡玉2，張成省2*

（1.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

測定了嶗山40種常見中藥材提取液對煙草黑脛病菌的抑菌活性。結果表明，10 g/L乙醇提取物濃度下，有11種植物（占27.5%）提取物對煙草黑脛病菌抑制率達100%，有28種（占70%）抑菌率達80%以上。對公丁香提取液相對含量較高的4種組分的抑菌效果進行了進一步測定，結果表明，丁香酚和乙酸丁香酚酯10倍稀釋液對黑脛病菌抑制率高，分別為100%和60.19%，說明丁香酚和乙酸丁香酚酯為公丁香的主要抑菌活性成分。本研究表明，公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治煙草黑脛病的良好應用潛力。

中藥材；Phytophthora nicotiana；公丁香；抑菌活性

煙草黑脛病是危害我國煙草生產的重要病害，常年發病率為5%～12%，每年造成巨額經濟損失[1]。目前生產上以化學防治為主，常用藥劑主要有甲霜靈錳鋅、霜霉威、烯酰嗎啉等[2]。由于藥劑品種相對單一，且使用年限較長，生產上已經出現了抗藥性菌株[3-5]。此外，由于成熟期發病嚴重，施藥防治易造成農藥殘留。因此，篩選和研究新的殺菌劑是一項非常迫切的工作。植物源殺菌劑被認為是化學合成殺菌劑最好的替代品，尤其是藥用植物更具有開發為植物源殺菌劑的巨大潛力[6]。與化學農藥相比，植物源農藥具有低毒、無殘留、選擇性高及不易使病菌產生抗藥性等優點而成為近年來研究與開發的熱點領域[7]。有關植物源殺菌素對煙草黑脛病防治研究鮮有報道。王傳吉等[8]報道了青蒿、苦參、蘄艾、廣藿香、金銀花等復配劑水提取物對黑脛病菌有良好的抑制作用，楊蘭等[9]研究發現大蒜素500倍液對煙草黑脛病防治效果可達46.1%。本研究以青島嶗山40種常見中藥材為試驗材料，測定其對煙草主要黑脛病菌的體外抑菌活性，并進一步追蹤抑菌作用強的藥材的主要有效成分，為研發抗煙草主要病害的新型植物源殺菌劑提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：40種青島嶗山中藥材名稱見表1（購買自北京同仁堂青島分店）。供試菌株：煙草黑脛病菌（P. nicotiana）由本實驗室從煙田采集感染病株分離純化獲得。培養基：燕麥培養基[6]。原藥：丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯和α-石竹烯（購買自Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥材提取液的制備 參考林勇等[10]方法。將購買的40種植物陰干，進一步于50 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，粉碎過0.425 mm篩。稱取50.0 g植物干粉于500 mL三角瓶，加入95%乙醇300 mL微波萃取法（微波爐調至中火，90 s），過濾并收集提取液，再加入300 mL 95%乙醇冷浸5 d，過濾并收集提取液，再次加入 300 mL 95%乙醇，超聲波（功率為600 W）提取1 h，過濾并收集提取液，合并提取液，在50 ℃下用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，回收溶劑，所得浸膏用甲醇定容為質量濃度100 g/L的溶液，獲藥材提取液，置于4 ℃保存備用。

1.2.2 煙草黑脛病菌抑菌試驗 采用生長速率法測定上述藥材提取物對病原菌菌絲生長的抑制作用[11]。將藥材提取液與燕麥培養基充分混和，配制成濃度為10 g/L的培養基平板，在超凈工作臺中將菌餅（用經消毒的9 mm的打孔器在培養好的黑脛病菌落邊緣打取帶菌培養基，即制成菌餅）移植到上述加入提取物的培養基中心處（一皿一個菌餅），將菌絲面向下接觸培養基。以等量甲醇作對照。每個處理3次重復。25 ℃培養5 d后，用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.2.3 藥材提取液化學組分抑菌試驗 參考本實驗室對公丁香提取物組分的分析結果[10]，選取丁香提取物中相對含量較高的化學組分，購買其單品的原藥，以甲醇稀釋10倍，參照1.2.2中方法，分別測定不同化學組分對黑脛病菌的抑菌效果，每個處理設3次重復，對照加入等量甲醇。

表1 供試藥材Table 1 Chinese herbal medicines tested in this study

2 結 果

2.1 煙草黑脛病抑菌試驗

所測定的40種藥材中有11種藥材對黑脛病菌表現出強烈的抑菌效果，菌絲生長抑制率均為100%，分別為貫眾、海州常山、白頭翁、金銀花、香附、丹參、虎杖、蒼術、東北龍膽、徐長卿和公丁香（表2）。除板藍根外，其他28種藥材抑菌率均在80%以上，抑菌作用十分明顯（表2）。

表2 40種藥材提取液對煙草黑脛病菌的抑菌作用Table 2 Inhibition of the extracts of 40 kinds of Chinese herbal medicines againstP.nicotiana

2.2 公丁香提取液化學組分抑菌試驗

根據本實驗室前期研究結果[10]，公丁香提取液中相對含量較高的化學組分，分別為丁香酚、乙酸丁香酚酯、β-石竹烯、α-石竹烯。選取以上4種組分的原藥進行黑脛病菌抑菌試驗。結果表明，4種組分中丁香酚含量最高，抑菌效果也最明顯，對黑脛病菌具有強烈的抑制作用，10倍稀釋液對黑脛病菌的菌絲生長抑制率均為100%；乙酸丁香酚酯10倍稀釋液對黑脛病菌的菌絲生長抑制率分別為60.19%；而β-石竹烯和α-石竹烯均無抑菌效果（表3）。

表3 公丁香4種化學組分對煙草黑脛病菌抑菌作用Table 3 Inhibition of four chemical components againstP. nicotiana

3 討 論

本文選取 40種嶗山中藥材[12]測定其乙醇提取物對煙草黑脛病菌的抑制作用，結果表明，嶗山具有豐富的殺菌植物資源。在10 g/L濃度下，對煙草黑脛病菌抑制率達 100%的植物有 11種（占比27.5%），抑菌率80%以上的植物有28種（占比70%），說明上述植物具有良好的防治煙草黑脛病的潛力。上述植物中，苦參、金銀花和藿香曾被報道對煙草黑脛病菌有抑制活性[8]，其余植物對煙草黑脛病菌的抑制作用均為本研究首次報道。本實驗室前期研究發現公丁香提取液對煙草青枯病菌具有良好的抑制作用，并采用GC-MS鑒定了其提取液中含有12個組分[10]。本研究測定的40種植物中公丁香提取液對煙草黑脛病菌的抑制率達到 100%，具有潛在的應用潛力。對公丁香提取液中含量較高的4種組分的抑菌作用測定表明，含量最高的丁香酚對煙草黑脛病菌的抑菌效果最好，說明公丁香為抑制黑脛病菌的主要活性成分。丁香酚在醫學上主要用于解熱鎮痛、抗炎麻醉等[13]，近年來有關丁香酚應用于植物病害防治的報道越來越多。Bai等[14]研究發現，丁香酚對煙草青枯病菌具有較強的抑制活性，能破壞菌體結構，降低病原菌代謝活性。丁香酚還用于植物病毒病的防治，比如煙草花葉病毒病[15]、番茄病毒病[16]等。本文研究表明，丁香酚對煙草黑脛病菌同樣具有強烈的抑制作用。由于丁香酚在自然界中來源豐富，生產成本低，將其作為新型殺菌劑原料進行開發應用，前景十分光明。下一步應深入研究丁香酚抑菌作用機理，并開展田間試驗，驗證防病效果。

參考文獻

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Inhibitory Activity of Forty Kinds of Chinese Herbal Medicines against Phytophthora nicotiana

GOU Jianyu1,2, PENG Yulong1, ZHANG Changhua1, XIA Yan2, KONG Fanyu2, ZHANG Chengsheng2*
(1. Zunyi Branch, Guizhou Tobacco Company, Zunyi, Guizhou 563000, China; 2. China Tobacco Integrated Pest Management of China Tobacco, Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China)

In this study, antifungal activities of ethanol extracts of 40 species of Chinese herbal medicines againstP. nicotianain vitrowere determined. The results showed that antifungal plant resources in Laoshan Mountain were rich. The inhibitive rates of eleven species (27.5%) reached 100% at the concentration of 10 g/L. 28 species had good inhibitive effects over 80% againstP. nicotiana. Determination of the antifungal activities of four fractions with relatively high content in the extracts of clove showed that 10-fold dilution of eugenol possesses the highest inhibitive rate (100%) againstP. nicotiana, while the inhibitive rate of eugenyl acetate was 60.19%. This study suggests that a big variety of plant species in Laoshan Mountain have antifungal activities, and the active ingredient eugenol of clove extracts has good potential as a biocontrol agent to control tobacco black shank disease.

Chinese herbal medicine;Phytophthora nicotiana; clove; antifungal activity

S435.72

1007-5119（2017）01-0064-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.011

中國農業科學院科技創新工程“灘涂生物資源保護利用”（ASTIP-TRIC07）；貴州省煙草公司遵義市公司“煙草真菌病害植物源殺菌素篩選與應用”（2016-09）

芶劍渝（1976-），男，碩士，研究方向：煙草生產技術。E-mail：goujianyuzy@126.com。*通信作者，E-mail：zhangchengsheng@caas.cn

2016-06-15

2016-09-12