細胞內外鈣在激動劑收縮結腸平滑肌中的作用

周 華，李 華，張 敏，張 晟，張 平，姜文濤

(安徽醫學高等專科學校基礎部生理教研室，安徽 合肥 230601)

·實驗研究·

細胞內外鈣在激動劑收縮結腸平滑肌中的作用

周 華，李 華，張 敏，張 晟，張 平，姜文濤

(安徽醫學高等專科學校基礎部生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的探討結腸平滑肌收縮效應與細胞內外鈣離子的關系。方法觀察有鈣和無鈣環境中，結腸平滑肌的收縮效應。同時用M受體阻斷劑阿托品阻斷受體作用，建立store-operated鈣通道，并研究其對結腸平滑肌收縮效應的影響。結果（1）無論是有鈣液中還是無鈣液中激動劑均引起結腸平滑肌收縮，在有鈣液內激動劑的作用更大；（2）神經遞質ACh誘導的結腸平滑肌收縮反應中，有store-operated鈣通道介導的Ca2+內流參與。結論激動劑誘導的結腸平滑肌收縮反應中，細胞內外鈣均有作用，而且胞內鈣庫耗竭激活的store-operated鈣通道也參與了收縮反應。

大鼠，結腸，鈣，store-operated鈣通道

鈣離子是細胞內重要的第二信使，它參與調節機體多種生命活動過程，如：神經傳導、肌肉收縮等。眾所周知，胞漿內Ca2+濃度的變化是啟動平滑肌興奮-收縮耦聯的核心[1]，而胞漿內Ca2+主要來源于兩個方面：細胞內鈣的釋放和細

胞外鈣的進入。在血管平滑肌上研究鈣信號用以對抗高血壓已得到廣泛開展，但對消化道平滑肌的研究相對較少。眾所周知，消化系統的消化功能與消化道的運動關系密切，消化道的運動即依賴消化道平滑肌的收縮，而Ca2+是觸發消化道平滑肌肌絲滑行的關鍵性因素。而胞內Ca2+的來源無非是細胞內鈣的釋放及細胞外鈣的進入。目前推測，消化系統炎癥疾病的病理性變化可能與細胞內Ca2+信號紊亂有關，最終引起消化道平滑肌收縮性降低。本研究旨在討論細胞內外鈣與激動劑引起的大鼠結腸平滑肌收縮之間的關系，并對其作用機制進行了分析，以期為臨床治療提供新的依據，為新型藥物的開發提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑

SD大鼠（安徽醫科大學實驗動物中心）；乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）、阿托品（atropine）、維拉帕米（verapamil）、EGTA、DMSO均購自美國Sigma公司。Krebs液組成如下（mmol/L）：NaCl 114.0，KCl 4.7，MgCl21.2，CaCl22.5 NaH2PO41.8，Glucose 11.5，NaHCO318.0，pH 7.4±0.5；無鈣Krebs液為正常Krebs液去除CaCl2，其它成分不變。

1.1.2 儀器

JZ-100肌肉張力換能器、HSS-1數字式超級恒溫浴槽（成都儀器廠），Powerlab生物信號采集處理系統（Australia AD Instruments）。

1.2 實驗方法

1.2.1 張力測定

健康SD大鼠，150～250 g，雌雄不拘。實驗前禁食18 h，頸椎脫臼處死，迅速從直腸上方4 cm處取出結腸腸段（約2 cm），置于Krebs液中。用組織剪剪去周圍組織，清除腸內容物，并去除腸管內皮層。將標本置37℃Krebs液浴槽內，通O2，調靜息張力為1 g。張力大小通過張力換能器輸入Powerlab數據采集處理系統進行記錄。標本均在浴槽內平衡1 h后開始實驗。所示的藥物濃度均為投入浴槽液中的終濃度。

1.2.2 實驗分組

激動劑-經典神經遞質ACh對離體大鼠結腸腸段收縮效應觀察分為三組：ACh組（對照組），細胞外液無鈣組，細胞外鈣恢復組。ACh組：即向置于有鈣Krebs液的結腸腸段，投入ACh 5μmol/L；細胞外液無鈣組：待ACh誘導的結腸收縮反應穩定后，分別用無鈣Krebs液沖洗腸管（0Ca組）或向浴槽中加入EGTA（+EGTA組）以去除細胞外液中的鈣；細胞外鈣恢復組：即再次向細胞外液中恢復Ca2+2.5 mmol/L。

1.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 13.0統計處理，數據用均數±標準差表示，統計學處理采用配對t檢驗，P＜0.05被認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞外鈣對激動劑誘導的結腸平滑肌收縮的必要性

與對照組相比，0Ca組和+EGTA組，ACh誘導的結腸收縮反應明顯降低，恢復胞外Ca2+后，張力大小又逐漸恢復（n=12，P＜0.001）。0Ca組中，張力（g）大小分別為：1.48±0.78，0.62±0.15，0.94±0.27；+EGTA組中，張力（g）大小分別為：1.44±0.40，0.72±0.18，1.54±0.26。

2.2 store-operated鈣通道與結腸平滑肌收縮

向無鈣Krebs液中的標本加入ACh 5 μmol/L，結腸迅速短暫收縮，該收縮依賴細胞內貯存鈣的釋放，收縮反應穩定后，再加入M受體阻斷劑atropine10 μmol/L（阻斷受體的作用），在此基礎上恢復細胞外 Ca2+至2.5 mmol/L，結腸出現持續性收縮，該收縮依賴store-operated鈣通道介導的胞外鈣內流。統計學結果顯示，細胞內鈣介導的收縮張力約（1.70±0.15）g，store-operated鈣通道介導的胞外鈣內流引起的收縮張力約（0.83±0.45）g，內鈣釋放介導的收縮張力約是胞外鈣內流介導的收縮張力的2.1倍。

3 討 論

潰瘍性結腸炎是一種病因未明的結腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病程漫長，常反復發作，給人類的生活帶來極大的困擾。臨床研究表現，潰瘍性結腸炎的病人，排便習慣發生改變，常見腹瀉。經證實，患者炎癥部位的平滑肌動力下降，使得結腸中食糜進行性往返運動的節段減少，加重腹瀉。而Ca2+在平滑肌運動中起重要作用，細胞內鈣穩態是維持其正常收縮和舒張的基礎，鈣穩態失衡可導致平滑肌收縮性改變，是許多疾病的病理生理學基礎。本實驗觀察了有Ca2+和無Ca2+條件下ACh對大鼠離體結腸平滑肌的收縮效應，以觀察神經遞質對結腸平滑肌收縮的機制，為臨床治療提供新的依據。

目前，對于store-operated鈣通道的激活又有了新的認識，可能與STM1和Orai1兩種蛋白有關。STM1位于SR/ER膜上，可以探測SR/ER內貯存的Ca2+的濃度，當貯存的Ca2+減少或耗竭時，STM1涌向ER/SR連合處，在那里它們直接與Orai1蛋白相互作用，并發送信號至Orai1蛋白，隨后通道打開介導Ca2+內流。因此，STM1和Orai1兩種蛋白被認為是組成store-operated鈣通道的最基本的功能單位。至于STM1和Orai1兩種蛋白是否會導致大鼠結腸平滑肌鈣穩態失衡而引起動力紊亂，尚需進一步探討。

[1] David C. Hill-Eubanks1, Matthias E. Werner2, et al.Calcium Signaling in Smooth Muscle[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(a004549):1-20.

本文編輯：王雨辰

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ISSN.2095-8242.2017.08.1398.02

2013年高校省級優秀青年人才基金重點項目：結腸SOC通道分子實質及該通道對腸道炎癥調控研究（2013SQRL118ZD）