流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜法快速同時測定復方丹參片中7種有效成分

蘇草茵，余諾君，吳宏星，鄭艾妮，李 寧

( 廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 511400)

流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜法快速同時測定復方丹參片中7種有效成分

蘇草茵，余諾君，吳宏星，鄭艾妮，李 寧*

( 廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 511400)

采用整體柱建立了流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜法快速同時測定復方丹參片中三七皂苷 R1，人參皂苷 Rg1，Re，Rb1，Rd，Rb2及丹參酮ⅡA 7種有效成分。通過對溶劑和流速雙梯度體系的逐步優化，并應用色譜模擬軟件 DryLab，得到分離7種成分的最佳色譜條件。采用色譜柱Merck Chromolith Performance RP-18e(100 mm×4.6 mm)，以乙腈-水為流動相體系，流速/溶劑雙梯度洗脫，柱溫30 ℃；片劑中的7種成分在 21 min 內達到基線分離；Rg1在 60.60～242.40 mg/L(r=0.999 0)、丹參酮ⅡA在16.52～66.08 mg/L(r=0.999 9)，其余皂苷在 30.70～142.66 mg/L(r≥0.999 4)范圍內具有良好的線性關系；定量下限(S/N=10)為 21～124 μg/kg，回收率為 96.7%～100.1%。該方法能在短時間內同時分離不同極性的化合物，提高被測物的柱效，減少半峰寬和拖尾，可應用于復方丹參片中7種成分的含量分析。

流速/溶劑雙梯度；整體柱；高效液相色譜法；復方丹參片；DryLab

復方丹參片由丹參、三七以及冰片組成，主要用于治療冠心病、心絞痛，是目前我國心血管病臨床應用最為廣泛的復方丹參制劑之一。研究表明，丹參的活性成分主要為二萜醌類脂溶性成分，具有抗氧化抗動脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量等心血管作用及抗腫瘤作用[1]。三七皂苷具有擴張血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板凝集、延長凝血時間、降血脂、清除自由基、抗炎抗氧化等藥理作用[2]。因此，建立一種對復方丹參片中丹參和三七中多種活性成分的定量分析方法，有助于有效地控制復方丹參的質量。

我國現行的國家藥品標準[3]采用高效液相色譜法(HPLC)對復方丹參片中的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，以及丹參酮ⅡA 5種成分的含量進行測定，但方法繁瑣費時。另有文獻報道采用HPLC同時測定其中4種組分或1種組分[4-8]，亦有同時測定丹參及三七有效成分的報道[9-11]，但分析時間長、效率低。由于三七皂苷R1,人參皂苷Rg1,Re的極性很強，人參皂苷Rb1,Rd,Rb2為中等極性，而丹參酮ⅡA具有強疏水性，因此，很難在短時間內采用HPLC進行有機溶劑/水等度或梯度洗脫。本文采用整體柱快速液相色譜法對上述7種組分進行了同時測定，在21 min內達到基線分離。

整體柱在藥物分析中的應用日漸廣泛，尤其在多組分藥物的分離測定方面顯示出巨大的優勢[12-13]。整體柱擁有平均孔徑為2 μm的三維大孔網絡以及13 nm的中孔，孔隙率>80%，具有極佳的通透性，同時為待測組分在色譜分離過程中提供充足的比表面積。特殊的結構使整體柱在高流速下仍保持較高柱效和較低柱壓[14]，因此，整體柱在用于溶劑梯度的同時還能實現流速梯度。流速/溶劑雙梯度法已在多組分樣品測定中得到應用[15-16]，該方法的特點是改變流動相中有機相的比例，以達到調整被測物的分離選擇性；同時調節流速，使其保留時間大大縮短，并且得到較窄的峰形，以提高柱效。本文嘗試將有機相比例與流速雙變量應用到等度與線性混合梯度中，并結合應用色譜模擬軟件DryLab，逐步優化分離參數，經過色譜優化參數(COF)評價，得到最佳的流速/溶劑雙梯度色譜的優化模型，從而建立了一種能夠快速、可靠、準確地檢測復方丹參片中7種有效成分的質量控制方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

日本Shimadzu高效液相色譜儀系統：包括LC-20 AB泵，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站；ELGA超純水儀(威立雅水處理技術(上海)有限公司)；HS6150超聲波清洗器(天津恒奧科技發展有限公司)；FA1104A分析天平。

三七皂苷R1(純度99.9%)、人參皂苷Rg1(純度97.7%)、人參皂苷Re(純度99.9%)、人參皂苷Rb1(純度99.9%)、丹參酮ⅡA(純度99.9%)購于中國藥品生物制品檢定所；人參皂苷Rd(純度94.2%)、人參皂苷Rb2(純度93.8%)購于中國食品藥品檢定研究院；復方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，規格：0.32 g/片)；實驗用水為色譜用超純水；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備 分別取真空干燥至恒重的三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd，Rb2，以及丹參酮ⅡA各10 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容，搖勻，作為對照品儲備液。

混合對照溶液：分別精密吸取不同體積上述標準儲備液置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

1.2.2 供試品溶液的制備 取復方丹參片15片，去除包衣后研細，精密稱取細粉1.0 g，置于100 mL具塞棕色瓶中，加入85%甲醇50 mL，密塞，精密稱定，超聲處理60 min，放冷，補足重量，搖勻后靜置10 min，過濾，取續濾液為供試品溶液。

陰性對照品溶液：按處方分別稱取除丹參以外的其余藥材及輔料，取除三七以外的其它藥材及輔料，按供試品溶液的制備方法，分別制成不含丹參、三七的陰性對照溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Merck Chromolith?Performance RP-18e(100 mm×4.6 mm)；流動相：A為乙腈，B為水；檢測波長：0～17 min，203 nm；17～21 min，270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速/有機溶劑雙梯度程序見表1。

表1 HPLC分離7種組分的流速/乙腈濃度雙梯度模式Table 1 Programs of the flow rate/acetonitrile content double-gradient modes for separation of seven test-compounds by HPLC

1.4 柱外體積的測定

死體積V0：在所用色譜系統條件下采用硝酸鉀水溶液進樣后測定保留時間,測得V0為1.69 mL；滯留體積VD：以二通管替代色譜柱，使用水流動相體系，以 0.3%的丙酮作為示蹤劑，以實際到達梯度1/2高度所運行的時間與設定梯度達到相應位置的時間之差來計算[17],測得VD為 2.82 mL。

2 結果與討論

2.1 第一梯度流速/溶劑的優化

2.1.1 第一梯度溶劑濃度的優化 選擇初始流速為 1 mL·min-1，分別測定流動相乙腈濃度為 16%，17%，18%，19%，20%，21%時,Rg1和Re的保留時間(t)和保留因子(k)(見表2)。從表2可以得出，乙腈濃度不宜超過 20%，否則Rg1與Re的分離度小于 1.5，無法達到基線分離。而乙腈濃度為18%～19%時，Rg1和Re的保留因子k在 0.5～15范圍內，且Rg1和Re可達到基線分離，因此實驗選擇乙腈濃度分別為18%，19%進行下一步流速優化。

表2 不同乙腈濃度中測定Rg1與Re的保留時間和保留因子Table 2 Retention times and retention factors of Rg1 and Re obtained in different acetonitrile content

2.1.2 第一梯度洗脫流速的優化 在溶劑濃度優化的基礎上,選擇18%乙腈濃度為模式1，19%乙腈濃度為模式 2,考察流速分別為1.3，1.5，1.8，2.0，2.5，3.0，3.2 mL·min-1時，R1，Rg1及Re的保留因子的變化規律，結果見表3。

表3 不同模式下R1，Rg1，Re 的保留因子與流速的相關性Table 3 Calibration curve of R1，Rg1，Re in the different modes

在反相液相色譜中，待測組分的極性越強，保留越弱；極性越弱，保留越強。3種待測成分的極性大小分別為R1>Rg1>Re。從表 3 線性斜率結果可知，極性最強的R1隨著流速增大，保留因子變化較小；對于極性稍弱的Rg1和Re，流速增大，保留因子的變化也隨之增大。因此，可通過調整流速來改變被分離組分的峰間距，從而改變選擇性。模式1在所有考察的流速下，Rg1與Re的分離度均大于1.6，但隨著流速的增加，柱壓隨之增大，為保護色譜柱，選擇流速 3.2 mL·min-1作為模式1第一梯度流速。模式2考察的流速為2.0 mL· min-1時,Rg1與Re的分離度為1.47，無法達到基線分離；而當流速為1.8 mL·min-1時，Rg1與Re的分離度為1.65。因此選擇2.0～1.8 mL·min-1之間的1.9 mL·min-1作為模式2第一梯度流速。

圖1 DryLab 模擬3.2 mL·min-1，32%乙腈下Rb1，Rd，Rb2的圖譜Fig.1 Chromatogram of Rb1，Rd，Rb2 by DryLab in 3.2 mL·min-1 and 32%acetonitrile

2.2 第二梯度流速/溶劑的優化

選擇乙腈濃度為29%，30%，31%。分別測定在流速1.5，2.0，2.5，2.8，3.0，3.2 mL·min-1下Rb1，Rd，Rb2的保留時間以及峰面積。將所測得結果輸入DryLab 軟件，并由軟件模擬出洗脫3種待測物的圖譜以及相應的色譜條件。模擬結果表明在流速為1.5，2.0，2.5，2.8，3.0，3.2 mL·min-1時，乙腈比例分別高于33.72%，32.83%，32.11%，31.75%，31.65%，31.40%時，均能使Rb1，Rd，Rb2在4 min內完全洗脫。

盡管在多個不同的流速/溶劑范圍內均可實現4 min內完全洗脫3種待測組分。經實驗驗證，發現乙腈比例超過32%時，該階段基線起伏不平，影響待測組分含量測定。這是由于前后兩階梯度變化率過大所造成的結果。為使Rb1，Rd和Rb2能快速、平穩地洗脫，故選擇 3.2 mL·min-1，32%乙腈作為第二梯度的色譜條件。Drylab軟件模擬該條件下的圖譜見圖1。

2.3 第三梯度流速/溶劑的優化

按照第二梯度模式的優化方式，選擇乙腈濃度為60%，64%，68%，分別測定在流速1.5，2.0，2.5，3.0，3.2 mL·min-1下丹參酮ⅡA的保留時間以及峰面積。并將所測得結果輸入DryLab 軟件，由軟件模擬出洗脫丹參酮ⅡA的色譜圖以及相應的色譜條件，模擬結果表明在流速為1.5，2.0，2.5，3.0，3.2 mL·min-1時，乙腈比例分別高于92.0%，81.6%，73.9%，70.7%，69.4%均能使丹參酮ⅡA在2 min內完全洗脫。但實驗驗證時發現，乙腈比例不宜超過70%，否則待測樣品丹參酮ⅡA主峰無法與相鄰雜峰達到基線分離。為達到快速洗脫并減少干擾的目的，故選擇流速3.2 mL·min-1的70%乙腈作為第三梯度的色譜條件。

2.4 滯后時間的修正

表4 滯留體積與修正時間Table 4 Dwell time and corrected time

實驗所用的液相設備滯后體積2.82 mL。梯度洗脫時，增加的VD相當于在梯度開始時增加的等度延遲，使峰間距和樣品組分的分離度發生變化，而變化量與滯留時間有關。梯度洗脫實際起始時間應為扣除滯留影響后的時間。滯留時間可由下式求得:tD=VD/F。因此，各階段之間的梯度起始時間應修正提前，結果見表4。由表4可知，第一梯度若采用Mode 1進行洗脫，應扣除滯后時間0.88 min，修正為7.39 min進行第二梯度洗脫；若采用Mode 2進行洗脫，則應扣除滯后時間1.48 min，修正為7.35 min進行第二梯度洗脫。同理，第三梯度的實際起始洗脫時間應修正為扣除滯后時間0.88 min后的14.03 min。

2.5 流速/乙腈濃度雙梯度優化分離模式的確定

綜合各梯度流速/乙腈濃度的優化，可得出兩種分離模式下的結果，相關色譜圖見圖2。

2.6 方法學研究及復方丹參片含量測定

采用最終優化的模式 2,按 “1.3 ”色譜條件進行方法學研究及片劑的含量測定。首先注入混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，進行系統適用性試驗，記錄色譜圖，供試品結果見圖2 Mode 2，其余結果見圖3。理論塔板數按三七皂苷R1計算不低于4 500，7種待測物的拖尾因子不大于2，分離度均大于1.5，主峰峰面積的重復性RSD 均小于2%，陰性對照溶液未見干擾。

通過精密吸取不同體積的工作對照品溶液進行測定,以峰面積(y)對進樣質量(x,μg)進行線性回歸,求得7種待測物的線性方程;根據樣品信號與噪音信號比(S/N)為10 計算定量下限(LOQ)為0.021～0.124 μg/kg；稱取供試品0.5 g( 精確至0.001 g)至50 mL棕色量瓶中，加入混合對照品溶液適量，配制低、中、高3個質量濃度，按“1.2.2”方法平行制備6份樣品溶液，按“1.3”條件測定分析，分別得出7種待測組分的平均加樣回收率96.7%～100.1%(表 5)，RSD(n=6)為0.63%～1.4%，表明本方法的準確度和精密度良好。

CompoundSlopeInterceptrLinearrange(mg·L-1)LOQ(μg·kg-1)Recovery(%)Content(mg/pcs)NotoginsenosideR1-31765 75422035 540 999432 73～130 910 10197 20 429GinsenosideRg14940 33178135 420 999060 60～242 400 12499 13 925GinsenosideRe-1187 89225681 190 999631 47～125 870 02498 20 434GinsenosideRb18580 67246280 500 999935 66～142 660 115100 11 016GinsenosideRd765 3877527 20 999833 79～135 170 10498 30 185GinsenosideRb21480 86194712 850 999630 70～122 790 10897 50 315TanshinoneⅡA-1836 781 820 999916 52～66 080 02196 70 302

3 結 論

建立了一種流速/溶劑雙梯度反相高效液相色譜同時測定復方丹參片中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd，Rb2，以及丹參酮ⅡA 7種有效成分的分析方法。通過考察不同流速/乙腈比例雙梯度模式下的分離效果，并結合應用色譜模擬軟件 DryLab，減少了實驗次數，確定了最佳的流速/乙腈比例雙梯度模式。應用優化的色譜條件能同時分離復方丹參片中的7種成分，且在21 min內能達到基線分離。該方法可以同時分離強極性、中等極性以及脂溶性化合物，并能提高被測物的柱效，減少半峰寬和拖尾，從而為復方丹參片的質量控制提供了一種準確可行的方法。

[1] Du G H,Zhang J T.HeraldofMedicine(杜冠華，張均田.醫藥導報)，2004,23(6):355-360.

[2] Ma K,Tang J T.ZhejiangJ.IntegratedTradit.Chin.WesternMed.(馬珂，湯金土.浙江中西醫結合雜志)，2002,12(3):197-199.

[3] Pharmacopoeia Commission of People's Republic of China.Pharmacopoeia of People's Republic of China,Part 1.Beijing:Chemical Industry Press(國家藥典委員會.中華人民共和國藥典，一部.北京:中國醫藥科技出版社)，2015:1214-1215.

[4] Wu L R,Wang X F,Gao W D,Tang X Y.J.GuangdongPharm.College(吳立蓉，王秀鳳，高衛東，唐小婭.廣東藥學院學報)，2016,31(1):32-35.

[5] Ta N,Li C S,Song L.J.Chin.Med.Pharmacol.(塔娜，李常勝，松林．中醫藥導報)，2013,19(7):89-90.

[6] Wu D,Ye Q X,Wang D Q,Qin R A.WorldChin.Med.(吳笛,葉秋雄，王德勤，覃仁安.世界中醫藥),2013,8(2):201-204.

[7] Pan L.ModernDiagnosisandTreatment(潘磊.現代診斷與治療)，2012,23(6):693-694.

[8] Tu W S,Zhan Q J.Chin.Pharm.(涂文升，詹群軍.中國藥師)，2010,13(10):1450-1451.

[9] Wei Y H,Yao X J,Wu X A,Du W,Zhao G.The5thChromatographicAcademicReportintheNorthwestRegionandGansuProvince10thChromatographicConferenceProceedings.Gansu:The Northwest Chromatographic Annual Meeting.(魏玉輝，姚小軍，武新安，杜瑋，趙剛.西北地區第五屆色譜學術報告會暨甘肅省第十屆色譜年會論文集.甘肅：西北地區色譜年會)，2008.

[10] Zhang A B,Zhang J,Cheng Y F,Zhang C Y,Guo L,Liu Y S.HeraldMed.(張愛兵，張珺，程月發，張春雨，郭蘭，劉穎碩.醫藥導報)，2015,34(8):1067-1071.

[11] Cao J,Zhang S L,Liu J,Wang Y W.Chin.J.Pharm.(曹健，張詩龍，劉軍，王伊文.中國醫藥工業雜志),2011,42(5):365-367.

[12] Wang Y J,Zhou M Y,Han S L,Lu W.Chin.J.Exp.Tradit.Med.Formulae(王園姬，周明瑤，韓省力，盧聞.中國實驗方劑學雜志)，2012,18(11):82-85.

[13] Lubor U,Dagmar S,Bohuslav M,Josef D,Iveta S,Petr S.Anal.Chim.Acta,2006,573/574(1):267-272.

[14] Yang G L,Gao W H,Yang J.Chin.J.Chromatogr.(楊更亮，高文惠，楊靜.色譜)，2003,21(4):332-335.

[15] Li N,Pan X L,Huang G L,Gao C K.ActaChim.Sin.(李寧，潘曉玲，黃光亮，高崇凱.化學學報),2011,69(8):981-986.

[16] Cabrera K,Lubda D,Eggenweiler H,Minakuchi H,Nakanishi K.J.HighResolutChromatogr.,2000,23(1):93-99.

[17] Rodenas-Montano J,Ortiz-Bolsico C,Ruiz-Angel M J,García-Alvarez-Coque M C.J.Chromatogr.A,2014,1344:31-41.

[18] Helena B,Bo K,Linda G,Ingrid G.J.Chromatogr.B,2004,813:67-73.

Rapid and Simultaneous Determination of Seven Active Components in Compound Salvia Miltiorrhiza Bunge Tablets by Flow Rate/Organic Solvent Double-gradient High Performance Liquid Chromatography

SU Cao-yin,YU Nuo-jun,WU Hong-xing,ZHENG Ai-ni,LI Ning*

(College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 511400,China)

A flow rate/organic solvent double-gradient mode in reversed-phase high performance liquid chromatography(HPLC) by using monolithic column was established as a new approach for the rapid and simultaneous determination of notoginsenoide R1,ginsenosides Rg1,Re,Rb1,Rd,Rb2and tanshinone ⅡA in compound Salvia miltiorrhiza bunge tablets.Through the optimization of the flow rate/organic solvent double-gradient mode,and combination with chromatographic simulation software DryLab,the optimized double-gradient HPLC system for the seven active components was built.The determination was carried out on a Merck Chromolith Performance RP-18e(100 mm×4.6 mm) column using acetonitrile-water as mobile phase at a column temperature of 30 ℃.The separation of seven active components in the tablets was achieved in 21 min.The linear ranges were 60.60-242.40 mg/L(r=0.999 0) for Rg1,16.52-66.08 mg/L(r=0.999 9) for tanshinone ⅡA，and 30.70-142.66 mg/L(r≥0.999 4) for the other active components.The LOQs(S/N=10) were in the range of 21-124 μg/kg and the mean recoveries were 96.7%-100.1%.The method could be used for the simultaneous determination of different polarity compounds in a short time.It also could improve the column efficiency of the analytes,compress the half-peak width and reduce the trailing.Therefore,the method could be used for the rapid and simultaneous determination of the seven active components in compound Salvia miltiorrhiza bunge tablets.

flow rate/organic solvent double-gradient;monolithic column;high performance liquid chromatography(HPLC);compound Salvia miltiorrhiza bunge tablets;DryLab

2016-08-24；

2016-09-21

國家自然科學基金資助項目(81173525)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.010

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2017)02-0212-06

*通訊作者：李 寧，教授，研究方向：色譜新方法及藥物質量控制，Tel:020-39352136，E-mail:13724117338@163.com